技术解读｜CHIP技术简介

染色质免疫沉淀后测序(ChIP seq)是一种针对DNA结合蛋白、组蛋白修饰或核小体的全基因组分析技术。由于二代测序技术的巨大进步，ChIP-seq 比其最初版本ChIP-chip具有更高的分辨率、更低的噪声和更大的覆盖范围。随着测序成本的降低，ChIP- seq 已成为研究基因调控和表观遗传机制不可或缺的工具。
原理：甲醛处理细胞使目标蛋白与DNA 交联，通过超声波将交联后的染色质
打断成小片段，一般在200-600bp 范围内。再利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。最后，去交联并对纯化后DNA进行PCR扩增，高通量测序，最后与已有基因组序列进行比对，以确定 DNA 与蛋白质结合的序列。

问题分析：
1.甲醛交联对后续结果分析的影响？
自从Orlando V等人首次发明了ChIP技术，十几年后核心步骤仍无大变化。然而，ChIP-seq 技术实际存在一定的缺陷，例如甲醛交联。甲醛虽然是一种高度渗透的交联剂，但由于其反应活性仅限于胺，因此其交联效率较低；对哺乳动物细胞而言，其最大交联效率仅为1%。因此甲醛交联细胞所需的起始量很大，也因此该技术也很难适用于微量细胞及单细胞样本。牛津大学出版社发表的文章In vivo formaldehyde cross-linking: it is time for black box analysis指出，某些蛋白质如：阻遏蛋白，NF-κB等无法通过甲醛交联到DNA上，研究表明；在DNA上的停留时间短于5秒的蛋白质无法用甲醛交联。其次，甲醛会导致许多其它无关蛋白质交联到DNA上，影响后续分析数据。有报道称，甲醛交联会触发DNA损伤应答机制，从而改变染色体组分，进而使ChIP 结果产生偏向性。除此之外，由于交联反应在加热和低PH 的情况下会发生逆转，因此DNA蛋与白质的交联复合物的稳定性也是一个值得关注的问题。因此，甲醛究竟在多大程度上能反应细胞内蛋白质的分布仍不能确定。

根据有无甲醛交联步骤可以把CHIP 技术划分为两种类型，一类是存在甲醛交联的 ChIP，即X-ChIP（cross-linking and mechanical shearing ChIP）；另一类是无交联存在的ChIP，即N-ChIP（native-ChIP）；相较于X-ChIP，N-ChIP 技术有一系列的优点，包括：高分辨率（MNase的使用使得染色体的片段化可以小至核小体）、避免了甲醛交联带来的非特异性蛋白在DNA 上的富集、避免了甲醛交联对抗原表位的遮盖、步骤的减少降低了样品的损失等。然而，由于使用了MNase，N-ChIP只适用于研究组蛋白修饰，大部分情况下不能用于转录因子的研究。

2.超声波打断和酶断裂方法的比较？
酶类： 最常用的酶类如MNase，即：微球菌核酸酶，是一种能降解核小体连
接区的DNA 序列的核酸酶，最初从金黄色葡萄球菌中分离出来。
MNase 消化染色质可以释放出一个个独立的核小体。MNase 酶解法具有一定的局限性，首先，MNase 对于偏向于切割A/T 碱基位点，导致核小体在A/T富集区域的表达量低于真实情况；其次，MNase不能在核小体边界精确切割，这导致在确定染色质的开放位置与真实情况存在差异；而且，MNase 偏向于消化脆性核小体。在不同物种的实验证据表明，脆性核小体占据了基因启动子和转录终止位点，而脆性核小体只在MNase 浓度较低且消化时间较短的情况下才能被检测出来，因此很难将脆弱核小体量化到稳定核小体的相对丰度。
超声打断则不如酶裂解法温和，而且由于打断的不均匀性，导致测序结果背景噪音高，影响后续数据分析。由于文章篇幅限制，在此不多赘述。那么究竟选择酶解还是超声打断，需要视情况而定。可参考以下建议：
如果所研究的蛋白质高丰度表达且与DNA 结合紧密如组蛋白，那么样本无需
需交联，这时可使用酶解法。
如果所研究的蛋白质表达丰度较低或与DNA 结合不紧密如转录因子等，往往
需要用交联试剂将样本进行固定，稳定蛋白质和DNA 的形态，这时最好选用超声法进行断裂。
拓展：
适用于微量细胞水平的ChIP技术及其原理
1）CUT-Tag技术：
CUT-Tag可同时用于研究转录因子结合位点以及DNA的开放性。可在一天之内完成从细胞到建库完成的所有步骤，且具有高分辨率，低噪音等特点。起始细胞用量可低至50个。[1]
原理：利用抗原抗体特异性反应，加入特异性抗体与染色体上目标蛋白结合，加入二抗与该抗体结合以募集更多的pA-Tn5转座酶复合物至目标蛋白与DNA序列的结合位点上，转座酶复合物切割该染色质开放位点，并在切割后的DNA 片段两端加入接头，文库构建完成，可直接进行后续测序，与已有基因组序列比对，即可知道目标蛋白与DNA的结合位点。

2）ChIL-seq：
ChIL（chromatin integration labelling），即染色质集成标签技术，可同时用于研究转录因子结合位点以及DNA 的开放性，起始细胞用量为100-1000 个细胞。ChIL-seq 避免了传统ChIP-seq 技术中由于抗体沉淀所带来的回收率低的缺陷，尤其适用于贴壁细胞。对于活跃的组蛋白标记如H3K4me3 ，H3K27ac，起始细胞用量甚至可降低至单细胞水平。[2]
原理：在96 孔板中加入细胞，经固定，染色后加入一抗与目标蛋白结合，随后加入ChIL 探针（由二抗和ChIL DNA组成），探针中的ChIL DNA经Tn5转座酶整合到目标蛋白所在基因组DNA附近，随后T7 RNA 聚合酶经ChIL DNA中的启动子启动转录，以此处基因组DNA 为模板合成RNA，经DNase I 消化和裂解释放RNA，以纯化的RNA建库测序。

3．Drop-ChIP:
Drop-ChIP:使用了特定的微流控装置，分辨率可达到单细胞水平。该技术不仅可以在单细胞水平研究转录因子结合位点及组蛋白修饰，还可以从细胞特异性角度研究不同细胞间染色质的变异程度。我们认为，整合单细胞染色质和单细胞表达数据，可以使调控元件与靶基因更精确地耦合，并更深入地了解它们的功能动力学和关系。[3]
原理：首先，将待研究的细胞与裂解液，MNase 混合进行染色质消化，另外设计一个包含很多种不同接头的液滴，在微流控装置上反应，使得每一个细胞液滴与一种接头液滴混合，同时与含有DNA连接酶的buffer液滴混合。这个过程中，接头序列自动连接到裂解的染色质片段两端，进而进行细胞裂解，使用特异性抗体对目标蛋白进行沉淀，对富集后的DNA 进行测序。与已有基因组序列比对即可知道目标蛋白作用位点。

[1]. 1: Kaya-Okur HS, Wu SJ, Codomo CA, Pledger ES, Bryson TD, Henikoff JG, Ahmad K,Henikoff S. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun. 2019 Apr 29;10(1):1930.
[2]. Harada A, Maehara K, Handa T, Arimura Y, Nogami J, Hayashi-Takanaka Y, Shirahige K, Kurumizaka H, Kimura H, Ohkawa Y. A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input. Nat Cell Biol. 2019 Feb;21(2):287-296.
[3]. Rotem A, Ram O, Shoresh N, Sperling RA, Goren A, Weitz DA, Bernstein BE. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nat Biotechnol. 2015 Nov;33(11):1165-72