有趣的DNA聚合酶

UniPort数据库登记的DNA聚合酶被实验证实的都有1000多种，想要都介绍恐怕得写一本书。我选择了三个比较有趣的来聊一聊：
它可以不依赖引物，仅在一种叫做末端蛋白的辅助下，起始DNA的复制。
可以不依赖模板进行DNA合成的聚合酶。
能够在无引物情况下进行DNA合成的聚合酶。

Phi29 DNA Polymerase

Phi29 DNA Polymerase（后面简称Phi29）是从枯草芽孢杆菌phi29噬菌体基因组中发现的，它属于聚合酶家族B，具有极其卓越的持续合成能力和保真性。然而，1984年Blanco等（doi:10.1073/pnas.81.17.5325）就克隆表达了Phi29，1989年他们（Blanco, 1989）又报道了Phi29在体外DNA合成上的显著优势，它可以合成70Kb以上的DNA链。但当时并没有引起广泛的关注，可能是因为Phi29耐热性实在不好，而Taq DNA聚合酶等耐热酶又吸引了大批科学家的注意力，直到近些年来，随着单细胞测序、第三代测序等新技术的发展，Phi29开始聚焦人们的目光。

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想要深入了解Phi29的发现过程，我推荐可以仔细读一读“ø29噬菌体的40年（doi:10.1146/annurev.micro.61.080706.093415）”，这是Margarita Salas教授的一篇回忆录，介绍了她与ø29噬菌体的“风风雨雨”。Margarita Salas教授是西班牙人，最初从事有机化学的研究，后来到美国塞韦罗·奥乔亚（诺贝尔奖得主，尼伦伯格先生解析遗传密码所用的mRNA就是按奥乔亚教授的方法合成的）实验室进行博士后培训，成为一名优秀的生化科学家。另外，Salas教授的丈夫是Eladio Vinuela，他是SDS-PAGE技术的发明者之一。

Margarita Salas and Eladio Vinuela at the Center for Biological Research

Phi29蛋白全长575aa，相对分子量大约66KD，N端主要负责3'-5'外切酶校读功能和链置换功能，C 端结构域行使聚合功能，含有拇指、手掌、手指结构。Phi29的主要特征有：
①Phi29可以在末端蛋白质（TP）的辅助下，不依赖引物起始DNA复制；
②卓越的持续延伸能力（>70Kb）和优秀的保真性（有些商家为了宣传号称Phi保真性是Taq DNA聚合酶的1000倍，过于夸张了）；
③优秀的滚环复制活性和多重链置换活性；
④Phi29是一个常温酶，在30 ℃进行反应，65 ℃ 放置10 min便可失活。
Phi29最广泛的应用是滚环扩增（Rolling-circle amplification，RCA）和多重置换扩增（Multiple displacement amplification，MDA），下面简单介绍一下他们的原理。

• 滚环扩增
  

  滚环，通俗的说就是围着一个圆环转圈圈，以环状DNA 为模板，通过短的DNA/RNA引物( 也可以是一个切口) ，在酶催化下将dNTPs 转变成单链DNA。由于Phi29与DNA有很强的结合作用，而模板又是一个环，复制一圈后延伸并不会停止，新生链不断把互补链置换出去，最后形成的单链DNA包含几十上百个重复的模板互补片段，经过切割可以得到单位扩增子（如图1 ）。滚环扩增在噬菌体复制中是很常见的，如果为环状单链DNA（ΦX174），直接作为模板复制，如果为环状双链DNA，先通过切割酶产生一个切口，然后起始滚环复制。
  图1滚环复制图示

• 多重链置换扩增
  

  什么叫链置换呢？通俗的说，就是以模板链合成的新生链替代了原来的互补链。热循环PCR过程中的延伸也是一种链置换，不过一般说的链置换反应都是指等温扩增，因为没有温度变化也就没有阶段性，退火和延伸始终持续进行。什么叫多重链置换呢，就是“同时多处发生”，新生链的延伸还未完成，被置换的互补链又开启新一轮的置换，引物延伸始终处在“一波还未平息，一波又来侵袭”的状态，直至引物消耗完（见图2）。MDA基于两个基本条件：1.具有链置换能力的聚合酶，如Phi29，Bst DNA polymerase；2.随机引物，常见的是随机六引物和9引物。Phi29最常见的MDA是基因组扩增，大多采用随机引物，复制起始几乎无处不在，所得产物也是有小有大，随机分布（见图3）。
  图2 多重链置换扩增图示

图3 Phi29和随机引物扩增人基因组DNA

如果我们在体外利用滚环复制扩增质粒，会怎么样呢？这取决于你使用什么引物，使用随机六引物，结果就是下面这个样子。看完是不是混乱了，这种产物经过限制酶切也是弥散条带，不过在线性质粒位置应该有一条明显的亮带。

随机引物RCA扩增质粒DNA

如果使用两条特异性的引物，虽然也会从多处起始，但只能从特定的位置起始，而且每个起始位点之间都是一个完整的复制单位，下图是其中一条链的情况，第二链相同，复制完成后用限制性酶切即可得到单一的线性条带，我曾用Phi29滚过11Kb的质粒，效率很高。

正反向特异性引物RCA扩增质粒

可能有人会有疑问，既然Phi29延伸性能那么好，保真性有高，还能扩增高GC%的模板（我曾经用随机引物扩增过GC%大于80%的基因组片段，产量很高），为什么不用于常温PCR扩增大片段呢。如果用特异性引物，就存在两个主要问题：1. MDA的优势是多处起始，特异性引物就失去了这个优势，延伸时只能等新生链完成，互补链才能起始；2. 低温退火的特异性太差，会产生很多干扰产物。如果需要等温特异性扩增，可以考虑Bst DNA Polymerase，它可以在60-65℃ 进行RCA和MDA，不过Bst持续合成能力不如Phi29，也缺乏校正活性。

Phi29是个很有趣的聚合酶，无论是其催化性能还是扩增方式。对其进行高纯度分离纯化也是极困难的，它与DNA有强力的结合作用（当Phi29和热稳定DNA聚合酶共存时，耐热酶会引物无法使用模板PCR失败），很难去除与酶结合的DNA。用于基因组扩增、单细胞测序的Phi29要求大肠杆菌基因组拷贝<1，我尝试过PEI核酸沉淀+Ni柱+Heparin柱纯化流程，所得产物中仍有大肠杆菌基因组残留，即使再添加核酸酶预处理，增加离子柱也没有彻底解决该问题。有文献报道（doi: 10.1371/journal.pone.0082624）使用溴化乙锭竞争DNA可以得到无DNA残留的纯酶，但这种方法操作起来可能有风险，最后我在Ni柱前添加了羟基磷灰石柱吸附与DNA结合的蛋白质，才基本解决该问题。

DNA polymerases μ

DNA polymerases μ（后面简称Pol μ）全长494aa，来源于人类基因组，属于DNA聚合酶家族X，X家族目前有四个成员：DNA polymerases β，DNA polymerases λ，DNA polymerases μ和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。他们都是些性能奇特的聚合酶，想更多了解X家族DNA聚合酶的特征，可以仔细阅读Berdis（doi:10.1007/978-3-642-39796-7_5）和Yamtich等（doi:10.1016/j.bbapap.2009.07.008）的报道。

Domínguez等（doi:10.1093/emboj/19.7.1731）在2000年完成了Pol μ的鉴定及酶学性质研究，发现Pol μ同时具有模板依赖的DNA聚合酶活性和非模板依赖的末端脱氧核苷酸转移酶活性，但无模板聚合活性比有模板存在下的聚合活性第几个数量级。同年，Aoufouchi等（doi:10.1093/nar/28.18.3684）也报道了人Pol μ的克隆表达及酶学性质研究，结果他们没有检测到末端脱氧核苷酸转移酶活性（后来证明在大肠杆菌中的Pol μ被宿主修饰了，在大肠杆菌中表达的野生型Pol μ可能没有末端脱氧核苷酸转移酶活性）。我主要介绍下Domínguez的研究结果，他们来自于西班牙国家生物技术中心，与Phi29研究团队关系密切。
①利用RACE技术得到了Pol μ的cDNA，全长2589 bp，包括45 bp的5'-UTR，1482 bp的编码序列和1062 bp的3'-UTR。
②使用pRSET-hPolμ/BL21(DE3) pLysS原核系统表达重组蛋白，然后用PEI沉淀+硫酸铵沉淀+磷酸纤维素层析+HiTrap肝素层析纯化蛋白。
③Pol μ与TdT序列一致性为41%，具有末端脱氧核苷酸转移酶活性，但活性很低，而且存在掺入偏性：dT >> dC > dG > dA。
④Pol μ在存在DNA模板时聚合活性显著增强，但没有3'-5'的核酸外切或内切酶活性，而且延伸错误率很高。
⑤Pol μ的末端转移活性和依赖DNA的DNA聚合活性均在体外被锰离子强烈激活，而且，在存在Mn²⁺时，Pol μ的核苷酸掺入偏性明显降低。

NrS-1 DNA Polymerase

一般来说，DNA聚合酶都不是“从头合成”酶，他们总需要一条引物或者至少需要一个起始用的3'-OH（Phi29也是在TP与dATP形成的复合物的3'-OH起始）来进行DNA合成。在生物体内，有一类叫引发酶（Primase）的蛋白质，负责为DNA合成提供引物，他们与解旋酶、DNA聚合酶共同完成体内的DNA复制。NrS-1 DNA Polymerase（后面简称NrS-1）实际上一种“引发酶-聚合酶”双功能酶，可在没有任何引物的情况下从特定模板DNA序列启动DNA合成，并且在解旋酶和ssDNA结合蛋白的帮组下进行真正dsDNA扩增。

NrS-1不是第一个被发现的引发酶-聚合酶，早在2003年就在古细菌Sulfolobus islandicus的质粒上发现了一个具有ATPase，引发酶和DNA聚合酶活性的蛋白质（doi:10.1093/emboj/cdg246），后来又发现了来源于人（doi:10.1016/j.molcel.2013.09.025）和Thermus thermophilus（doi:10.1038/ncomms13296）等功能相似的酶。NrS-1与他们都不同，仅与古细菌质粒中的双功能引发酶-聚合酶具有弱同源性，但缺少通常存在于引发酶中的锌结合结构域。2017年，Zhu B等（doi:10.1073/pnas.1700280114）报道了NrS-1的克隆表达程序和酶学性质，主要内容包括：
①构建pET28b表达载体，转化大肠BL21（DE3），诱导表达后经Ni柱和Superdex 200柱分离纯化得到纯酶。
②NrS-1聚合能力较低，保真性差，NrS-1不依赖引物但需要ssDNA模板。
③NrS-1能够从dNTP和NTP上起始DNA合成，当dNTP和NTP同时存在时，NrS-1偏好dNTP。
④NrS-1的最佳反应温度为50°C，产物的长度从几百个核苷酸到约2,000个核苷酸，聚合反应需要Mg²⁺，最佳浓度在5至10 mM之间。
⑤NrS-1从头合成效率在不同DNA模板上的巨大差异，完全互补的DNA的两条链的扩增效率可能相差若干倍，必须有特定的起始序列，最短为8bp（5'-TTTGACCA-3'）；
⑥NrS-1结构上与古细菌引发酶具有弱同源性，N端截短结构仍有从头合成能力，但活性低于全酶，N端负责聚合，C端负责DNA结合；
⑦NrS-1在解旋酶或ssDNA结合蛋白的协调下，能够增强延伸能力，但随着NrS-1浓度增加延伸长度逐渐减小。

NrS-1的发现改变了人们对DNA聚合酶不能从头合成DNA的教条性认识，不但有趣而且意义重大，Guo H等（doi:10.1016/j.bbrc.2019.01.144）解析了NrS-1的晶体结构，有兴趣的可以仔细了解下。

结语

在传统的认识中，进行DNA合成时必须要有DNA模板和引物，而本文介绍的聚合酶（Phi29 DNA Polymerase不需要寡核苷酸引物，但需要DNA模板，且需要末端蛋白的辅助；DNA Polymerases μ可以不需要模板，但需要引物，且存在模板是聚合能力显著增强；NrS-1 DNA Polymerase不需要引物，但需要模板。）拓宽了人们对DNA复制方式的认识。