题目：Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2
期刊：Nat Protoc.
通讯作者：Rickard Sandberg
1. 背景
越来越明显的是，由于内在的随机过程和外部因素(如周围的微环境)，体内或体外细胞培养中看似均匀的细胞群在表达模式上可以显示出相当大的异质性。需要单细胞分辨率来增加我们对细胞间变异性的理解。我们的团队最近证明了Smart-seq能够从单细胞和少量纯化的RNA中生成定量和可重复的数据。
2.问题及目的
使用Smart-seq2，我们进一步改进了逆转录(RT)、模板切换和预扩增，以获得更高的单细胞cDNA产量，以及更高的灵敏度、更少的技术偏差和更小的可变性。
3.工作流程
4.方案优化
该方案是针对单细胞开发的，但同样适用于纯化的几皮克或更多的总RNA。
4.1 单细胞悬液制备
细胞首先应该分解成单细胞悬浮液，你应该在接近生理条件下进行快速处理。漫长的过程会导致基因表达发生不必要的改变，更糟糕的是，会导致大量细胞群死亡。因此，应立即提取细胞(如果可能，在30分钟以内)，并立即将细胞置于含有核糖核酸酶抑制剂的裂解缓冲液中，该抑制剂可阻止RNA降解并稳定RNA。
在采集过程中，含有单细胞的试管或平板应保存在冰上或IsoFreeze PCR架上，如果不立即处理，则应在−80°C保存。
4.2 单细胞裂解
使用了一种相对温和(低渗)的裂解缓冲液，能够在不干扰或抑制RT反应的情况下裂解细胞。裂解液中还含有游离dNTPs和寡核苷酸引物(30-nt poly-dT stretch and a 25-nt universal 5′ anchor sequence)，它们对聚腺苷化RNA序列上的RT反应起启动作用。在初始步骤中加入游离dNTPs来提高RT-PCRs的产量，可能是通过稳定RNA -引物杂交的机制。
4.3 RT
当使用商用Smart-seq时，RT反应通常在42°C下进行90分钟。然而，一些rna形成了二级结构(如发夹状结构或环状结构)，这可能导致酶由于空间位阻而终止链的延伸。在某种程度上，添加海藻糖(trehalose )和甜菜碱(betaine, N,N,N-trimethylglycine)可以克服这种不良影响。虽然一些研究表明，海藻糖不加其他添加剂，或与甜菜碱联合使用，能够增加cDNA产量，但我们单独使用甜菜碱获得了更好的结果。因此，我们的方案使用甜菜碱，一种具有两个重要作用的甲基供体:它增加蛋白质的热稳定性，并通过破坏DNA螺旋的稳定来减少甚至消除DNA热融化转变的碱基对组成依赖。甜菜碱对G-C对的破坏比A-T对的破坏更有效。虽然它对RT的有益作用在几年前就已经确立，但直到最近，当使用模板切换寡核苷酸(TSOs)时，它才被证明可以提高全长cDNA的产量。
我们还发现，添加甜菜碱(1 M)后，cDNA产量的增加需要氯化镁浓度的增加。Mg2+与甜菜碱分子的羧酸阴离子形成离子对，在生理条件下实际上是一种稳定渗透剂，帮助细胞应对渗透压的变化。最近的一项研究表明甜菜碱在1mM MgCl2以上成为DNA不稳定剂。与该研究一致，我们发现9-12 mM MgCl2的最终浓度是最大化cDNA产量的必要条件。虽然有报道称，过多的MgCl2对PCR的保真度有负面影响，但我们没有观察到RT中使用的Superscript II (Invitrogen)或PCR中使用的KAPA HiFi DNA聚合酶有任何负面影响。
通过添加甜菜碱，我们还可以利用其蛋白质的热稳定特性来改变RT进行时的温度。在42°C(根据制造商的说法，这是Superscript II的最佳条件)下90分钟后，我们将温度提高到50°C(失活前的上限)2分钟，以促进任何RNA二级结构的展开。然后我们再次将其降低到42°C 2分钟，以完成RT，并重复此循环共10次，以最大限度地提高cDNA产量。我们按照Carninci et al.的建议选择了10个循环，尽管该实验没有使用TSO。顺便说一句，在我们的设置下，10到15次循环似乎也能使产量最大化。
模板转换反应依赖于2-5个非模板的核苷酸，当RT到达RNA的5′端时，这些核苷酸被添加到cDNA的3′端。在其最初的版本中，该反应在其3 '端包含一个携带三个核鸟苷的TSO。因此，Moloney小鼠白血病(M-MLV)逆转录酶能够切换模板并合成与TSO互补的序列。每个全长cDNA携带转录本的整个5 '端和一个额外的人工序列，在这种情况下，该序列与位于oligo-dT引物5 '端(即mRNA的3 '端)的序列相同，使得后续的PCR使用单个引物成为可能。Smart-seq2使用在第三和倒数第二位置携带两个核鸟苷的TSO和一个修饰的鸟苷来产生一个锁定的核酸(LNA)作为3 '端的最后一个碱基。这些锁定的核苷酸的特征是在呋喃环的O2 '和C4 '之间有一个内部键，由亚甲基连接。这种修饰在分子中引入了一个构象锁，然而，它仍然保留了天然核酸的物理性质。LNA的两个有趣性质可能对我们的协议有利:LNA单体的热稳定性增强;以及它们对cDNA的非模板3 '延伸的强烈退火能力。
4.4 PCR预扩增
在第一链反应之后，cDNA被扩增使用有限的周期，通常在单细胞中扩增18个周期，或为接下来的步骤获得足够的材料所需的周期(一个或几个纳克的cDNA就足够了)。为了简化方案，提高灵敏度和适应液体处理自动化，我们在PCR前取消了珠(AMPure XP)介导的第一链cDNA的纯化。这是通过使用KAPA HiFi HotStart ReadyMix实现的，它取代了SMARTer协议中使用的Advantage 2聚合酶混合物。顺便提一下，KAPA HiFi最近在细菌基因组测序中进行了测试，发现与未扩增的样本相比，KAPA HiFi引入的偏差最小。
4.5 Tn5打断和建库
我们使用标记法从扩增的cDNA快速有效地构建测序文库。tagentation反应利用了Tn5转座酶的超活性衍生物，在体外催化将预定的寡核苷酸整合到目标DNA中。这种方法的主要优点是DNA碎片和适配器连接在一个步骤中发生，并且不需要大小选择。通过对破碎点周围层序组成的比较，发现其偏置特征比与机械剪切方法相关的偏置特征更强。尽管如此，人们发现这对人类基因组的覆盖范围几乎没有影响。因此，我们可以合理地假设全长cDNA消化后产生的片段均匀地覆盖整个转录的长度。
标记DNA文库中的片段平均大小通常在200到600 bp之间，可以进行富集PCR。我们遵循了Illumina开发的协议，允许通过使用双索引策略(称为索引1 (i7)和索引2 (i5))汇集多达96个样本。样品富集PCR后聚集在一起，并在Illumina测序仪的同一通道上测序。
5 协议的优势和局限性
该方法有几个优点，简要总结如下:
•它提供了分析数百个细胞的可能性，成本是目前可用的商业试剂盒的一小部分。与广泛使用的SMARTer工具包相比，我们的协议可以以12%的成本生成质量更好的库。
•它允许全长cDNA的恢复，因为M-MLV逆转录酶更倾向于全长cdna而不是翻转的cdna作为其末端转移酶活性的底物。因此，可以分析每个转录本的所有外显子并检测不同的剪接变体，这比以前的方法有很大的优势。它还可以进行全面的SNP和突变分析，扩大其应用领域。
•它允许高度的多路复用;多达96个样品可以在Illumina测序仪的单个通道上进行合并和测序。
然而，仍然存在一些限制:
•该方法对polyA+RNA具有选择性，排除了对polyA− RNA的分析。
•不反映mRNA的链特异性。
•尽管测序时具有高多路复用，但样品的池化在适配器连接富集PCR步骤后进行。与早期的多路复用方法(例如，CEL-seq9或strt7,10)相比，相对较高的手工劳动可以通过适应自动液体处理平台(如Agilent Bravo)或微流体解决方案(如Fluidigm C1)的协议而减少。
（单孔单独操作一个细胞，工作量大）
5 未来的应用
由于每个样品成本的降低和吞吐量的增加，许多应用是可行的，包括(但不限于)以下:
•从原发肿瘤的不同区域分离单细胞，以获得细胞异质性的信息。已有研究表明，实体瘤通常由多个克隆亚群组成，这使临床分析数十万个细胞的大量RNA或DNA样本感到困惑。来自这种混合肿瘤细胞群的基因表达谱可能因肿瘤内不同细胞群的贡献而有强烈的偏倚，因此不可能辨别决定恶性表型的特征。此外，在单细胞水平上的初步外显子序列研究表明，实体瘤和造血肿瘤可以显示出非常不同的克隆起源。我们有理由认为，需要分析来自不同肿瘤区域的大量单细胞，以更好地了解肿瘤的进化和进展。
对构成发育中的胚胎、组织或整个动物的不同细胞类型的研究，目的是建立干细胞、祖细胞和分化细胞的发育等级。
6 实验步骤（需注意）
6.1 引物
TSO (5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3′) At the 5′ end, this TSO carries a common primer sequence, whereas, at the 3′ end, there are two riboguanosines (rG) and one LNA-modified guanosine (+G) to facilitate template switching. Dissolve TSO in TE buffer. TSO can be stored in 100 μM aliquots at −80 °C for 6 months. Avoid repeated freeze-thaw cycles.
Oligo-dT30VN (5′–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3′) This anneals to all the RNAs containing a poly(A) tail. The 3′ end of this oligonucleotide contains ‘VN’, where ‘N’ is any base and ‘V’ is either A, C or G. The two terminal nucleotides are necessary for anchoring the oligo- nucleotide to the beginning of the polyA tail and to avoid unnecessary amplification of a long stretch of adenosines. Dissolve the oligonucleotide in TE buffer, to a final concentration of 100 μM. Store this oligo at −20 °C for 6 months.
ISPCR oligo (5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′) This oligo acts as PCR primer in the amplification step after RT. Dissolve the oligonucleotide in TE buffer to a final concentration of 100 μM. This oligo can be stored at −20 °C for 6 months.
6.2 片段大小
ds cDNA： Ampure XP beads (1:1 ratio)
cDNA预扩增和纯化后，第一次确定初始细胞的整体质量。这通常使用安捷伦生物分析仪进行。一个好的库的平均大小应该是1.5-2 kb和少量的短片段(图2a)。在次优预扩增的情况下，引物二聚体的峰值将高于cDNA文库(图2b)，在极端情况下，大多数引物连接体扩增(图2c)。用降解RNA制备的文库的特点是向短片段转移，即使可以扩增较长的片段(图2d)。
lib：If we are starting from 100 pg of amplified cDNA, we usually perform 12 index PCR cycles.AMPure XP beads in a ratio of 0.6:1； the expected size of the library is ~300–800 bp, and the amount of adapter dimers is low .