- 原文：Understanding how microbiomes influence the systems they inhabit
- 作者：Ed K. Hall
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作者单位：Colorado State University, Fort Collins, CO, USA
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摘要：
- 转换关于微生物群落（环境，宿主或形成的环境）的信息越来越丰富，以增进我们对系统级过程的理解，这是一个特殊的研究挑战。造成这一挑战的原因之一是，通常在缺乏健全的概念框架的情况下评估微生物群落特征与它们所影响的系统级过程之间的关系，并且在未阐明潜在因果机制的情况下进行报告。对相关方法的依赖限制了将单个关系的推理扩展到其他系统并推动该领域发展的潜力。我们建议将研究重点放在微生物群落如何影响其栖息的系统上，并应在一个共同的框架内开展工作，并针对有助于系统级目标过程的已知微生物过程。
- 在这里，我们确定了微生物组特征的三个不同类别（微生物过程，微生物群落特性和微生物成员），并提出了一个框架，以经验方式将这些类别彼此联系起来，并影响它们所涉及的更广泛的系统级过程。我们认为，区分可以使用组成分类群（菌群聚集性状）预测的微生物群落特性与当前不能使用组成分类群（紧急特性）预测的那些特性特别重要。微生物生态学中的现有方法可以应用于更明确地阐明这三种微生物特征类别中的性质，并将它们彼此联系起来。我们认为，从对环境微生物组学和生态系统过程的广泛研究中收集到的这一拟议框架是一条有前途的途径，它有可能在广泛的微生物学领域中促进发现和理解。
主要观点：
实际上，所有生态系统过程均受微生物影响，许多过程仅由微生物进行。 有时这导致了这样一个假设，即对微生物组（包括其相关的转录本，蛋白质和代谢产物）进行更好的描述应该可以导致对系统级过程的更好的理解和预测。 但是，这些理由假设微生物组的可测量特征（例如16S rRNA基因文库，元基因组，酶促活性）可以告知我们更好地理解和预测这些过程的能力。 不幸的是，除了单独的环境因素可以预测的以外，有关微生物组的其他信息并不总能使人们对生态系统过程有更清晰的了解。
最近的两项宏基因组分析(meta-analyses)表明，在生态系统科学与微生物生态学的交汇处进行的研究通常依赖于微生物组特征与生态系统过程之间的假定关系，并且经常不检验这些关系是否存在。 第一项是对415项研究的检查，发现几乎没有证据表明蛋白质编码基因（有时称为功能基因）或基因转录物与相关的生物地球化学过程相关。 尽管所有研究都试图（或假定）将微生物基因或转录物与功能联系起来，但只有14％的人同时测量了基因或转录物的丰度以及相应的过程。 当同时测量了基因和相应的过程并检验了两者之间的关系时，只有38％表现出正相关。 无论功能基因或转录本的丰度用作反应变量，这一结果都是一致的。
第二项研究汇集了148个研究的单独数据集，这些研究检查了微生物对成员和生态系统过程的响应，以应对实验过程。 尽管40％的纳入研究报告了微生物组成和生态系统过程的伴随变化，但其中只有三分之一的案例报告了对微生物组成和生态系统过程之间显着关系的测试。 许多研究（64％）没有明确提出关于微生物成员与生态系统过程之间联系的假设。 在确实提出假设的53项研究中，超过一半（53％）的研究没有报告对提出的假设的统计联系的检验。
微生物群是为系统级过程提供动力的引擎。 但是，所描述的宏基因组分析表明，目前研究微生物组特征与生态系统过程之间联系的方法还不够完善，而且暗示了这些关系，但很少进行测试。 当测试关联性时，有时会出现微生物组特征与生态系统过程之间的显着相关性，但更常见的是这两个因素之间存在歧义。其一个原因是，许多研究是在缺乏概念框架的情况下进行的，该框架说明了不同的可测量微生物特征如何相互关联以及与系统级目标过程之间的关系。
将微生物特征与生态系统过程联系起来
- 试图将微生物信息关联性到系统级过程的当前概念研究框架通常无法有效地与所应用的方法或这些方法生成的数据保持一致。 例如，环境因素影响着单个生物的生理，从而改变了它们的竞争能力，丰富度，并最终改变了它们对生态系统过程的贡献。 但是，根据此框架设计观察性研究或实验时，假设可以在影响系统级过程的时空尺度上跨生态组织的多个类别（即个人，人口和菌群）测量环境和微生物特征（ 图1a）。 此外，环境变量与微生物特性之间的关系可以在时间和空间上解耦，并且通常是非线性的。 最近的迁移，表型可塑性，采样时环境与现有微生物组之间的不平衡，功能冗余和休眠都可以掩盖可测量的微生物特性与微生物影响过程之间的关系（图1b)。 随着微生物群落的微米尺度特征（10–6 m）被缩放到生态系统水平（微米到千米），我们假设我们的概念理解也是可扩展的。 但是，每个上述混杂因素在多个数量级上聚合，通常掩盖了我们试图阐明的关系（图1b）。 为了正式确定可测量的微生物组特征与系统级过程的联系方式，我们在概念上定义了微生物与生态系统生态学的交叉点，并确定了三类微生物特征，以说明它们之间如何相互作用以及如何对生态系统过程做出贡献（ 图2）。
图1：微生物与生态系统的关系图
a，示意图，显示通常如何在生态组织的各个层次上概念化关联性。b，一系列生态现象，在尝试将一个生态组织的一个层次与另一个生态组织的层次联系起来时，会带来挑战。
图2：微生物（垂直）生态系统（水平）生态学之间的交汇点概念图
- 该图说明了文本中定义的三种微生物特征类别（微生物过程，群落特性和微生物成员）。我们主张越来越多地关注阐明途径E，F，G和K的研究。此外，我们注意到途径I和J不太可能有效地将微生物组特征纳入系统级科学。在每个类别中，∆表示重点在于类别内的更改如何导致关联类别的更改。字母F的虚线箭头表示当前无法将许多新兴属性与成员资格相关联，这是积极研究的重要领域。CAT，菌群综合特质；EP，紧急属性。
将生态系统过程映射到微生物特征
- 定义生态系统过程，其关键子过程以及驱动这些子过程的代谢途径的已知系统发育分布，可以创建一条明确的概念途径，将生态系统过程与对其产生影响的微生物联系起来。 生态系统过程被定义为一个池中的质变，或从一个池到另一池的通量（例如，NH4 +到NO3–，或溶解的有机物到CO2）。 理解微生物组如何影响生态系统过程的第一步是定义目标生态系统过程以及对其作出贡献的每个子过程（即，组合起来确定净通量的一组组成反应）。 生态系统过程是互补的或拮抗的子过程的组合，这些子过程是由系统发育和代谢多样化的微生物进行的。 例如，净生态系统生产率是碳固定和碳矿化的对立过程之间的平衡。 净生态系统生产力的每个子过程可以进一步划分为一系列代谢途径（例如，化学自养硝化和光养自养碳固定，或异养发酵和有氧呼吸）。 可以继续以这种分层方式对每个生态系统过程进行分区，直到子过程直接映射到特定的微生物代谢途径（例如，破土甲烷化甲烷生成）。 随后，这些代谢途径中的每一个都可以归类为系统发育上宽泛的或狭窄的11。 广泛的过程在系统发育上很普遍（也就是说，广泛地分布在分类单元中），而狭窄的过程在系统发育上是保守的（仅限于分类单元的特定子集）。 例如，反硝化作用和光合作用是系统发育上广泛的过程，而产甲烷和甲烷甲烷化目前都被认为是系统发育上狭窄的过程（至少有一个值得注意的例外）。 第二步是确定每个组成子流程的控制或约束。 例如，模型生物中单个代谢途径的动力学可能有助于我们理解狭窄过程的限速步骤，但是模型生物的见解捕获表型广泛过程的全部反应的可能性要小得多。 系统发育多样性生物之间的变异可能更大。 一旦将生态系统过程从概念上划分为其组成部分及其主要控制，便可以采用协调一致的方法来研究微生物组的特性如何在自然环境的复杂性内影响目标生态系统过程。
微生物特性类别
- 微生物群对生态系统过程的贡献是通过由微生物成员和环境因素共同决定的聚集群落特性来发挥的。 当前大多数研究很少阐明微生物特征的测量在其特异性（即系统发育分辨率的水平），精度（该方法重复描述感兴趣特征的能力）或背景（特征与其他微生物之间的关系）方面如何不同。 特性或生态系统）。为了帮助设计将微生物与其影响的过程联系起来的实验，我们提出了三种不同的微生物特征类别：（1）微生物过程； （2）微生物群落特性； （3）微生物隶属关系（图2）。 提出的框架使研究人员能够清楚地识别出用于表征微生物组的不同测量值如何相互影响，并确定每种特性在阐明微生物对系统级过程的贡献方面的潜力。 微生物群落的所有可测量特征（例如，细胞丰度；基因，转录本或蛋白质序列；酶表达或活性）都可以置于上述类别之一。 在更广泛的范围内确定每个微生物类别的概念结构为改进微生物组研究中的观察性和实验性研究设计提供了机会。
微生物过程
微生物过程是微生物组的集体代谢，有助于元素或化合物池和通量的变化（即，图2，途径K）。 这是微生物信息的一类，可以很容易地将其纳入系统级模型，因为许多微生物过程代表了促成特定生态系统过程的关键子过程（例如，甲烷生成+甲烷甲烷化≈甲烷外排）。 生态系统科学中通常测量的微生物过程包括固氮，反硝化，硝化，磷吸收和固定化，固碳和有机碳矿化。 许多微生物过程的发生率可以通过生理测定（例如，估计微生物呼吸所需的生物需氧量）来估算，尽管它们没有打开微生物群落的“黑匣子”，但它们确实直接量化了微生物的贡献（或 潜在的贡献）来改变框内移动的资源。 微生物过程可以与其他微生物特征区分开来，因为它们都是比率（也就是说，它们在分母中有时间），并且需要进行生物测定才能估计。
用于估计微生物过程的分析通常在逻辑上具有挑战性，需要不可避免地偏离原位条件的操作，并且通常取决于从中采样微生物组的环境。 例如，温度和微生物过程之间的关系，例如酶活性和磷的利用效率，分别在纬度梯度和季节之间变化。 因此，温度对酶活性或磷利用效率的影响的观察取决于测量它们的位置（例如，在什么纬度）和时间（例如，在哪个季节）。 在缺乏对潜在生理机制的理解（例如，使菌群在不同温度下表现不同的生理变化）的情况下，必须通过以下方法来测量环境驱动因素（例如温度）与微生物过程之间的关系： 在每个位置和每个时间进行直接测定。 这限制了仅依靠对微生物过程的测量来了解微生物对生态系统过程的贡献的推断。 微生物群落特性 微生物群落特性包括广泛的微生物特征，例如群落生物量或生物量元素比率（例如，生物量C：N或C：P比率），以及大多数基于系统发育的未分化聚集序列的测量（例如基因 丰度，元基因组，转录组）。 微生物群落特性（图2）代表了微生物组的综合特征，具有预测或至少限制微生物过程估计的潜力。 例如，微生物群落生物量C：N（一种菌群资源）已显示出微生物组在陆地，淡水和海洋生态系统中矿化或固定氮的潜力。
微生物群落特性可分为两类：紧急特性和群落综合性状。 通常认为，涌现特性是指整体的质量，该质量是唯一且可与其组成部分的累加特性区分开的。 在某些情况下，可能会从其组成部分预测出涌出的特性，例如，可以基于每个结构内碳原子的原子组织来预测碳聚合物的物理特性。在微生物生态学中，我们对组成部分和结构的理解 它们之间的相互作用往往不足以预测紧急情况。 在这里，我们使用生态学21先前定义的“紧急性质”：“生态单元的紧急性质是完全无法通过观察该单元的组成来预测的”，这也与它在微生物生态学当代的使用一致 。
微生物群落的新特性影响重要的生态系统过程。 例如，在流水沟中进行的一系列实验模仿了流生物膜的发育和代谢。 随着微生物生物膜密度的增加，瞬态存储（即，水及其在生物膜附近的溶质相对于周围水流的停留时间增加）增加了。 在这种情况下，生物膜密度是微生物组的新兴特性，瞬时存储是其介导的微生物过程。 新兴特性的另一个例子是影响关键微生物过程的性状分布。 基于特征的方法在生态学上有着悠久的历史，并已越来越多地用于解决微生物生态学多个领域的问题。 例如，有机底物的吸收通常可能涉及多个基因的表达-在各个生物之间是不同的-尽管潜在效率不同，但所有基因都能够执行有机底物的吸收。 这些功能基因变体的表达分布产生了特征分布，该特征分布是微生物组的新兴特性。 这种新出现的性状分布决定了该微生物组对该功能的总体表现（即对有机底物的吸收），但不能通过使用当前方法从赋予该性状的生物的存在中进行预测。 尽管表征新兴特性可能会增进对微生物过程的理解（图2，途径G），但目前，最通常无法仅基于组成分类单元（即成员）来估计或预测它们（图2，途径） F），因此必须仍然是环境驱动因素（图2，途径C）和微生物过程（图2，途径G）之间的中介。
*与新兴特性不同，可以通过其组成特征来估计群落聚集性状，并提供将微生物群落成员与驱动微生物过程的群落性质联系起来的途径（图2，途径E）。 例如，菌群聚集的性状可包括通常测量的菌群特性，例如根据定量PCR估算的功能基因丰度（例如，pmoA，其编码参与甲烷氧化的酶的一个亚基，可用于估算甲烷化的潜力，以及 作为甲烷营养生物的系统发育标记）。 最近的一篇观点文章讨论了菌群聚集性状在微生物生态学中的作用，指出了一系列其他假定的菌群聚集性状（例如最大生长率，休眠，渗透压），可以从现存菌群的宏基因组学数据中推断出。
- 了解成员资格可以预测哪些菌群属性是一个关键的研究问题，也是了解微生物组如何促进系统级过程的重要一步。 菌群资源可能是新兴资源还是菌群聚集的特征，是令人兴奋的研究领域，并为推进微生物与生态系统的联系提供了重要的框架。 研究生态菌群中更高层次的相互作用等新方法可以帮助我们了解微生物组的成分如何相互作用以形成新的特性。 这并不是一项艰巨的任务，但是“应用和测试所提议的框架”一节中讨论的一系列现有方法提供了直接应对这一挑战的能力。
微生物群落成员
尽管现在通过对系统发育标记（例如，内部转录的间隔区或16S rRNA和18S rRNA基因的区域进行测序）或系统发育保守的蛋白质序列套件进行序列分析，可以识别出组成微生物分类群，但微生物系统发生的直接耦合 生理和生态学仍然难以捉摸（图2，途径H）。 通常，伴随系统发育分析的相关生理数据或种群表型信息的匮乏限制了菌群成员分析可能产生的系统级推断。 即使已知生物的生理学，似乎许多代谢途径在系统发育上都很广泛，并且任何给定的微生物组都将包含多种微生物，这些微生物的基因编码许多相同的常见微生物代谢途径，通常称为 功能冗余。 在特定的微生物代谢途径受到限制的情况下，似乎也没有一致的系统发育分辨率。 这限制了我们将微生物过程归因于相对简单的环境财团的菌群成员的能力。 很明显，微生物种群不是在空间和时间上随机分布的，而且某些微生物性状在较粗的分类尺度上是保守的，但在整个环境梯度上，微生物分类群非随机分布的生理机制通常是未知的。 对大多数细菌门的代谢的了解有限，这是目前阻止我们将微生物在环境中的丰度与其在相关微生物过程中的作用联系起来的能力的一个因素。
前进的道路 (A path forward)
我们建议，微生物组学的一个挑战性但必要的步骤是从确定微生物组的特征与系统级过程之间的相关关系，转向确定更多的因果关系和机械关系。 概念图（图2）是一个路线图，用于组织和关联性目前可供研究人员使用的各种可测量的微生物特征。 图2没有代表这些组件在环境中如何相互作用。 相反，它是一张地图，该地图确定了可测量的微生物与系统级特征之间的潜在联系，可以帮助构建我们对微生物如何影响其栖息系统的探索。 传统上，生态系统生态仅限于环境参数与生态系统过程之间的相互作用（如图2的水平箭头所示）。 同样，微生物生态学（图2中的垂直箭头所示）历来关注微生物群落的系统发育未定义方面（例如细菌丰度）和微生物过程（例如细菌产生），微生物分离物的生理学（用于 例如，减少硫酸盐的细菌）或具有已知成员资格的高度减少的菌群的集体生理（例如，废水处理微生物组）。 在环境微生物研究中常规使用基于序列的方法，导致对世界微生物群落的描述越来越详细，并且对这些微生物群落的组成部分如何相互作用以影响整个系统的兴趣也越来越高。
当前，研究人员使用多种方法尝试将微生物组的特征与生态系统过程联系起来。 微生物成员与生态系统过程之间的直接联系（图2，途径I），或群落特性与生态系统过程之间的直接联系（图2，途径J）已被证明难以建立3，4。 我们建议：（1）先验确定哪些微生物过程可能有助于生态系统级的库和通量（图2，途径K）； （2）确定哪种微生物群落特性最能描述和预测这些微生物过程（图2，途径G）； （3）确定最能描述每个过程的菌群属性是菌群聚集的特征还是新兴属性（菌群属性，图2）。 如果菌群资源可能是菌群聚集的特征，则探索微生物成员与菌群资源之间的联系可能会导致进一步的了解，并可能增强预测能力（图2，途径E）。 但是，如果菌群资源很可能是紧急资源，在目前的理解下，阐明有助于紧急资源的微生物成员不可能提高对该菌群资源驱动因素的了解（图2，途径F）。 将微生物组研究正式化为结构化的概念框架应有助于研究界更好地关注微生物组特征与最有可能通过经验发现的系统级过程之间的潜在联系。 这种方法还将使研究人员可以在不同的系统中测试定义的微生物组特征之间的相同途径，从而增加了解所观察到的相关性的因果机制（或没有因果关系）的可能性。 因此，如果未来的研究工作着重于阐明通过微生物生态学的完整路径建立联系（图2，途径E，F和G，蓝色箭头），而不是阐明微生物成员或群落特性与生态系统之间的直接联系，那么它们将是最有力的。 过程（图2，路径I和J）。
应用和测试建议的框架
应用和测试所提出的框架将取决于能否更稳健地表征每种微生物特征并直接测量连接每种类别的箭头的能力（图2）。 分离株的标记/分选方法和表型描述都提供了一个机会，可以更好地了解微生物成员如何影响群落特性（图2，途径E和F）。 标记和细胞分选方法（例如，荧光原位杂交（FISH）与流式细胞术分选细胞或免疫捕获，例如与溴脱氧尿苷（BrdU）结合使用）提供了强大的工具来限制微生物组的复杂性并直接检验假设， 将成员资格与菌群资源或微生物过程联系起来。 例如，一项对北冰洋细菌群落的研究使用BrdU标记了该群落的活跃增长组成部分，然后使用免疫捕获技术将这些种群与群落的其余部分分离，从而更好地了解了导致次生的微生物组部分 生产。 此外，对代表重要群落特性的分离株的生理研究有可能加深我们对表型可塑性在构造组成种群如何贡献或不贡献群落特性中的作用的理解（图2，途径E或F）。 对常见的环境操作分类单位（OTU）的隔离株进行的详细研究表明，给定的OTU（即微观多样性）存在巨大的差异，部分解释了将成员资格与菌群资源联系起来的挑战。 例如，对Prochlorococcus的研究已经使人们更好地了解了单个OTU中的生态型如何导致温度和底物亲和力的特化。 构成微生物组序列丰度很大一部分的OTU为进一步研究可能的表型可塑性和/或微生物多样性提供了潜在的候选者14。 例如，发现Verrucomicrobia门类中的一种Spartobacteria类单一系统型存在于广泛的土壤生态系统中，占从草原土壤返回的所有16S rRNA基因序列的多达31％，使其非常适合用于 有针对性的隔离和生理学研究。 对环境隔离物的研究对于建立对菌群成员如何对菌群特性有贡献或没有贡献的广泛理解至关重要（图2，途径E和F）。
除了更好地描述每种微生物特征之外，从相关描述性方法向致病性机理方法的重要一步是测量图2中用字母表示的箭头。还有一套强大的方法 已经被微生物生态系统采用，可以有效地测量图2中所示的许多箭头，包括混合群落的稳定同位素探测（SIP），可以分析环境中存在的生理状态细胞的单细胞方法 ，并用稳定同位素标记单个细胞以进行单细胞分析。 使用SIP或以任何形式将同位素标记的底物追踪到种群中的研究已成功地将微生物成员与微生物过程联系起来（图2，途径H）。 例如，对苏格兰泥炭地的一项研究使用SIP揭示，泥炭地中单种的Desulfosporosinus最有可能导致硫酸盐还原的总量，尽管它仅占所检索的16S rRNA基因序列的0.006％。 除了使用SIP关联性微生物成员和微生物过程的示例（图2，途径H）之外，还有一套与培养无关的技术（例如拉曼光谱，NanoSIMS或能量分散光谱（EDS））可以 通过报告原位单个细胞的生理和表型特征来补充基于序列的微生物组分析。 拉曼光谱法和NanoSims均可与一系列原位杂交技术（例如FISH）结合使用，以识别哪些种群对群落特性（图2，途径E）或微生物过程（图2，途径H）有贡献。 。 例如，一项对美国马萨诸塞州海岸Sippewissett盐沼的微生物群落的研究使用FISH和NanoSIMs的组合来确认自养紫色硫细菌和减少异养硫酸盐细菌之间的营养关系44。 这些现有的用于确认生态生理的方法，可以直接测量在稳定的微生物群中将成员与微生物过程联系起来的箭头（在这种情况下，是碳固定和硫酸盐还原；图2，途径H）。
这些与培养无关的方法还具有潜力，可以开始确定哪些菌群属性是紧急属性，哪些是菌群聚集的特征。 例如，微生物群落生物量化学计量（例如生物量C：N或C：P比）目前无法从其组成分类单元的列表中进行预测（甚至限制）（图2，路径F）。 然而，微生物生物量的化学计量是一种菌群特性，可以预测微生物对养分循环的贡献（图2，途径G）。 EDS可以测量原位生长（即不在培养中）的单个细菌细胞的C：N：P。 将EDS分析与系统发育标签耦合的潜力为在自然条件下分析混合微生物群落和评估系统发育特性与生物量化学计量之间的联系提供了机会。 这种方法将提供菌群成员资格与菌群资源（例如，生物质C：N；图2，途径E）之间的直接联系，后者影响重要的微生物过程（即养分循环利用）。 这些与基于序列的分析相结合应用的方法有可能根据经验将此处定义的微生物信息类别（图2）与其影响的过程联系起来，从而使微生物组学从描述性和相关性方法转变为机械性和因果性方法。
微生物组研究的设计
- 此处介绍的框架提供了一种跨微生物组科学的形式化研究的方法，并鼓励了系统中生物体的存在与表征该系统的过程之间的经验联系。 尽管我们从环境微生物群落及其所居住的生态系统中提取了示例，但这种结构化方法可能有益于分析与其他系统（例如宿主生物和人为构建的环境微生物）相关的微生物群落。 建立微生物成员，菌群属性，微生物过程和生态系统过程之间的因果关系不仅很重要，而且还要确定何时由于上述混杂因素（图1）或其他原因而不太可能出现这些联系 。 不加选择地寻求确定相关性的研究可能会将所有微生物特征置于同一个平面上，并且没有明确地认识到微生物特征之间的关系，这可能会继续产生矛盾且模棱两可的结果，不仅不能提供对生态系统过程的新见解， 但也模糊了确实存在的连接。 我们建议，与其在每项研究中寻找微生物组成员与系统级过程之间的联系，不如从战略目标锁定的联系和过程中受益，而对微生物生理学的先验理解应使我们能够增进对生态系统的了解，这将有助于研究工作。