空间转录组样本准备指南

样本类型：

• 目前 10x 官方测试的样本类型包含人、小鼠和大鼠各器官（皮肤、胰腺以及成骨组织暂时还不适用）。

• 对于人、鼠较为特殊的组织样本，比如胚胎、眼或较为柔软纤薄的组织，会有一定的难度，难点在于冷冻包埋时要保持其原本的形态结构，以及调整到合适的位置以利于切片。建议先拿组织进行一些冷冻包埋和切片的预实验，多练习和尝试。

• 其他物种样本，尤其是哺乳类样本，可进行尝试，但会有一些风险。建议先收集样本，进行组织冷冻包埋和质检，质检合格的样本成功率更高一些。

• 植物的样本目前不在讨论内容范围内。

新鲜样本收集与预处理：

• 应尽量收集新鲜的组织样本，避免室温长时间放置，避免污染。如果是临床样本，建议尽量将组织放在盛有组织保护液或生理盐水的离心管或者密封袋中，然后埋入冰中，短暂保存和运输。

• 关于组织大小：样本截面大小应不超过6.5mm X 6.5mm。如果是过大的样本，建议在速冻前先进行组织分割成多个小块，样本过大可能会导致组织冷冻不均匀，破坏组织结构。如果样本过小（<3mm），可在冷冻包埋时将多个样本同时进行。

冷冻和包埋：

根据组织冻存和包埋的顺序，可选用两种方式：(1) 先冷冻后包埋，(2) 冷冻和包埋同时进行。

| 先冷冻后包埋

新鲜的组织需要进行速冻以避免 RNA 降解和冰晶的形成。组织速冻后，需要用 OCT 包埋，以保持组织结构，并在切片时提供结构支撑。

>> 材料准备

• 新鲜组织在冷冻前应放置干净的器皿或者离心管中，并放置在冰上；

• OCT 放置在冰上，预冷30分钟；

• 镊子等直接接触冰冻组织的器材放置在干冰上，预冷30分钟；

• 准备液氮-异戊烷：将异戊烷倒入金属烧杯中（异戊烷的量应足够浸没组织块），然后将金属烧杯放置在液氮中，预冷15分钟。(异戊烷可能会结冰，说明此时异戊烷的温度低于其熔点-159.4℃，将异戊烷从液氮中取出室温放置一会儿即可。异戊烷预冷的时间不一定非要长达15分钟，10分钟即可。这主要取决于液氮和异戊烷的液体量。)

>>> 组织冷冻

• 先将组织切成合适大小；

• 用医用纱布轻轻擦去组织块上的血迹或者其他液体，以减少组织表面冰晶的形成；

• 用镊子或抹刀将组织块浸没在已经预冷的异戊烷中，速冻1分钟或者直到组织完全冷冻；

• 组织冷冻好之后放入预冷的冻存管或者模具中，并放在干冰上，准备包埋。

• 冷冻组织也可放入密封的冻存管中，放置在-80冰箱长期保存。

>>> 组织包埋

• 标记冷冻模具，记录组织方向等；

• 将冷冻模具放在平整的实验台上，先加入少量的在冰上预冷的 OCT，避免产生气泡;

• 将冷冻好的组织从干冰或者-80冰箱中取出，用已经在干冰上预冷的镊子将其放入冷冻模具 OCT 中，补充 OCT 并调整组织块合适的方位，OCT 需完全包埋组织块，避免产生气泡；

• 建议把想要切的组织面尽量朝上或者朝下，调整好合适位置后，再慢慢补加 OCT；

• 立即将模具放在干冰上，直到 OCT 完全冻结；

• OCT 包埋的组织块经修块后，可放入密封的冻存管中，放置在-80冰箱长期保存，或者也可进行组织切片操作。

| 冷冻和包埋同时进行

有些组织（比如胚胎等）非常柔软，失去液体的支撑就会改变其正常形态，对于这样的组织可采取冷冻和包埋同时进行的方法。

>>> 材料准备

• 新鲜组织在冷冻前应放置干净的器皿或者离心管中，并放置在冰上；

• OCT 放置在室温；

• 准备液氮-异戊烷：将异戊烷倒入金属烧杯中（异戊烷的量应足够浸没组织块），然后将金属烧杯放置在液氮中，预冷15分钟。

>>> 组织冷冻和包埋

• 先将组织切成合适大小；

• 用医用纱布轻轻擦去组织块上的血迹或者其他液体，以减少组织表面冰晶的形成（如果无法完全去除液体也没有太大关系）；

• 先在包埋盒中加入少量的 OCT，覆盖底层就可。将组织转移到包埋盒，小心调整组织的方位。接下来在包埋盒一侧小心缓慢地加入 OCT 至浸没组织。然后将包埋盒转移到预冷的异戊烷上冷冻。（如果没有液氮-异戊烷，也可用粉末状干冰或者干冰上预冷的金属块替代）

• OCT 包埋的组织块经修块后，可放入密封的冻存管中，放置在-80冰箱长期保存，或者也可进行组织切片操作。

冷冻包埋方法不仅仅局限于上述两种方式，组织类型差异大，如果某些冻存方法（如液氮蒸汽法，干冰蒸汽法等等）速冻包埋后质检合格，那么也是可以用于尝试进行空间转录组实验的。

样本质检：

由于各种不同组织之间的异质性，以及冷冻包埋操作的区别，我们强烈建议冷冻包埋后的组织客户先进行样本质检。

正式的空间转录组实验之前，会对组织进行样本质检质检的内容主要包括组织形态学检测和RNA 完整性检测。

• 组织形态学检测

冰冻切片，做普通 H&E 染色即可。主要观察组织形态上是否完整，比如是否有大的裂痕、冰晶形成而产生的气泡、褶皱等，在客户可以接受的范围之内。

• RNA 完整性检测

收集冰冻切片10~20片，提取 RNA，跑2100检测。理想情况下 RNA RIN 值应大于7，对于组织 RNA RIN 值在5~7的样本，也可以进行尝试，但是可能会出现基因检出数偏低的情况，对于组织 RNA RIN 值小于5的样本，不推荐进行空间转录组测试。

实测结果示例：

某肿瘤样本 UMI、Gene 和 cluster 空间分布