扩增子质控流程多，专属名词来揭晓

在高通量测序王国中， Raw reads（或raw data）已不陌生，但在扩增子测序的质控数据中还有Raw tags、Clean tags、Effective tags等一串的专属名词，这些名词代表什么，分析要关注哪些数据，测序数据量要选择多少可以满足需求呢，带着这些疑问，我们将为您一一揭晓：

首先简单说下扩增子的实验过程，与其他产品区别就是增加了扩增环节，扩增是依据测序仪器的读长和目标序列，设计特异引物对基因组进行扩增，得到目标片段后上机测序读取碱基序列，进而进行生物学分析。也由于进行了扩增，所以对应的产品命名就叫做扩增子了，同样由于扩增子广泛应用在微生物多样性研究中，也被叫做微生物扩增子测序。对应的实验流程如下：

图1 实验流程图

测序完成后就是数据质控部分了，首先奉上的是Raw reads、 Raw tags、Clean tags、Effective tags的关系图，即质控流程图：

图2 质控流程图

接下来就是专业的名称解释了：

Raw reads：测序的原始图像数据经 base calling 转化为序列数据，一般称之为 raw data 或 raw reads，结果以 fastq 文件格式存储 （文件名：*.fq）。fastq 文件为用户得到的最原始文件，里面存储 reads 的序列以及 reads 的测序质量，由于为双端测序，一个样本会对应两个fastq文件：raw_1.fq，raw_2.fq，分析对应read1序列文件和read2的序列文件。

每个 fastq 格式文件中每个 read 有四行信息，相信大家也不陌生了，展示如下：

@HWI-EAS80_4_4_1_554_12

GTATGCCGTCTTCTGCTTGAAAAAAAAAAACATAAAACAA

+HWI-EAS80_4_4_1_554_126

hhhhhhhhhhhhhhhhhhh[hEhSJPLeLdCLEN>IXHAA

4 行信息说明如下：

第 1 行是序列名称，由测序仪产生，包含index序列及read1或read2标志；

第 2 行是测序序列，由 “ACGT”组成，也就是用于分析的序列信息了；

第 3 行是序列ID，也有省略了ID名称后直接用“+”表示一行信息的；

第 4 行是序列的测序质量，每个字母对应第 2 行每个碱基的质量值，报告中常见的Q20、Q30就是依据这个来计算了；

Raw tags：将双端测序得到的read1和read2根据overlap的碱基进行拼接，从而获得目的片段得碱基序列，得到的序列即为原始Tags数据（Raw Tags），拼接原理如下：

图3 flash拼接示例

Clean tags：熟悉二代测序都懂，原始数据中会含有一些低质量的碱基或者序列，为保证后续分析的准确性，需要对Raw Tags经过严格的过滤处理得到高质量的Tags数据（Clean Tags）。

effective tags：Clean tags序列通过与物种注释数据库进行比对检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列，就可以得到最终的有效数据（Effective Tags）。后续的数据分析也就在此基础上进行了。

再补充个嵌合体小tips：

嵌合体序列由来自两条或者多条模板链的序列组成，如图所示，在扩增序列X的过程中，在序列延伸阶段，只产生了部分X序列延伸阶段就结束了，在下一轮的PCR反应中，这部分序列作为序列Y的引物接着延伸，扩增就会形成X和Y的嵌合体序列。而实际上嵌合体在正常生物体中是基本不存在的，所以在扩增子测序的分析中，需要去除嵌合体序列。

图4 嵌合体形成示意图

以上就是扩增子数据从下机到正式进入分析前的质控流程了，了解这些名词的含义，开篇提出的疑问就so easy了。

问：扩增子分析要关注哪些数据?

答：数据从Raw reads到Effective tags是层层过滤得到的，最终用于分析的数据为Effective tags，故拿到质控报告后需重点需要查看该数值。

问：测序数据量要选择多少可以满足需求呢？

答：前边说到，我们需要重点关注Effective tags，但由拼接效率、碱基质量、嵌合体等影响，不能直接推断的Effective tags与Raw read换算公式。因此我们NCBI数据库中随机下载了近三年发表的2005个扩增子样本数据，首先统计的基于Raw reads水平，不同数据量下的样本数目和占比如下：

样本的Effective tags统计如下：

综合两表来看，NCBI官网中扩增子样本数据集中在Raw reads 3w-10w（65.1%），Effective tags 集中在0-3w（77.7%）；同时对3w-10w的Raw reads进行细致反馈划分，发现多数样本测序数据集中在5w左右，故推荐的测序数据为5w。

图5 不同Raw reads范围中样本个数