单细胞scRNA-seq测序基础知识笔记

该笔记来源于 B站up 江湾青年 以及 Costa Lab - Bioinformatics Course

关于 scATAC-seq的请移步

scRNA-seq技术

首先是如何测序，上图瓶中有很多细胞，然后让这些细胞一个一个进入右边的管道，管道的下边那个管道一个一个进入小球，理想情况下是每个小球会与一个单细胞进入同一个液滴中，这个小球等于是这个细胞的一个标记物。当然也可能会有一个液滴混入了两个细胞等情况，后边我们做数据处理的时候会把这种情况剔除。
（我也不太确定理解的对不对，但大概就是这样，最近刚入门生物信息处理，我完全没有这方面的背景知识。不过其实也无所谓，这只是大概了解下数据是怎么来的，但实际项目中只需要专注于后边的数据就行了，至于数据怎么来的其实好像我并不需要关心。 当然有写的不对的地方也请读者朋友指出，在下不胜感激！）

scRNA-seq 分析流程

主要流程就是，首先获取数据后要先预处理(质量控制)，然后聚类和除去批次效应，最后是细胞类型的注释。

数据预处理

首先我们拿到的数据应该就是如上图所示那样，是一个矩阵，行是样本(细胞？)编号，列是基因编号。中间的数据比如“30” 就可以解释为 基因 “A1BG” 在第一个样本中检测到了30个(次?).

然后因为并不会在每个细胞中都能检测出某个基因，所以上图这个矩阵的大部分区域都是0，所以是一个稀疏矩阵。

我发现做生物信息的人好喜欢可视化呀，不过也确实有用，比如上图就是常用的提琴图(因为长的像个小提琴)可视化来分析数据。

先介绍下小提琴图怎么看，例如上图第一个提琴图，每个小点就代表一个细胞，行可能代表不同的细胞类型、组织类型、实验条件或有兴趣比较基因表达水平的任何其他分组。列代表这个细胞检测到的基因的数量。

小点背后那个红色的区域象征着细胞在这个基因数量下的细胞密度，可以看到红色区域越宽，小点越密集。

然后怎么用这个图呢？可以看出有些离群的细胞，比如第一个图最上边有几个细胞的基因数都超过3000了，这种可能就是刚才说的一个液滴里混进了俩细胞， 像这种情况我们可以设置一定的基因数量限制，seurat给出的建议是 限制在 200 ～ 2500左右，当然我们可以视实际项目的情况而定，另外也可以设置一个动态的数值，比如整体中位数加减某个数值。

聚类

标准化数据

由于测序数据可能样本间文库大小差异问题， 测序深度不一样（其实就是每次测的多少都有点差异呗）就用下图这个标准化公式，好像确实有道理，就像DL处理图像一样，把像素点也要先归一化再使用。

筛选有用的数据

对于拿到的scRNA数据，很多基因出现在了大多数样本中，我们应将这类基因筛除掉，因为基因差异越大才会有更多不同的信息（去除共性，保留个性），那怎么除去呢？

一个方法是计算每个基因在所有细胞中出现次数的方差，学过统计学的都懂，方差越大表示数据间的差距越大，那么这个基因个性越大，越可能有一些特殊的信息。然后我们就可以按方差从大到小来排列这些基因，然后选取方差最大的比如说前2000个高变异基因这样。

数据降维

因为一般细胞数据维度比较高，而且会有噪声，我们经常用PCA（Principal Component Analysis）给数据降维，但是只用PCA降维后的点做聚类的话，边缘会不清晰，所以一般会先用PCA降到比如说50个主成分，然后再用t-SNE或者UMAP降到二维的点再聚类，同时PCA也能顺便降噪（错了的话请留言让我知道）

聚类 Clustering

如上所说，将数据降维到二维的点后，一般是用KNN或者SNN聚类，详细请移步.

另外也要考虑批次效应，比如对于不同目标采样相同部位的数据，可能可视化出来如下图的误差。

消除批次效应的方法如下：

注释细胞类型

就是等聚好细胞的类之后，可以对比下每个簇和已知的哪些基因一样，就可以得知这个细胞簇来自哪些细胞，从而为细胞添加注释。

如果是用机器自动注释的话，原理就是它会自动对比已知的基因库，从而添加注释，但缺点是我们实际用的数据可能在软件的基因库里查不到，所以可以用自动+手动的方法，自动跑个大概，然后手工检查一遍。

scRNA数据分析

在处理完数据后，可以用上边几种算法来处理 处理好的数据。

结尾

嗯，我觉得这个up的视频作为对我这种小白的入门视频非常好，对整个的流程有了一个大概的认识，然后再配合这个 Scanpy Tutorial 一起食用效果最佳，这个示例代码就是按照这个up主讲的顺序一步一步做的。