《生物化学与分子生物学》----酶促反应动力学----听课笔记（九）

第九章  酶促反应动力学

5.2.1 酶促反应动力学（1）

• 酶促反应动力学是研究酶促反应的速率以及影响此速率的各种因素的科学。
• 酶与底物的中间络合物学说：

1. 在低底物浓度时，反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。
2. 随底物浓度增加，反应速度不再呈正比例增加，表现为混合级反应。
3. 当底物浓度达到一定值，反应速度达到最大值，此时再增加底物浓度，反应速度不再在增加，表现为零级反应。
4. 提出学说：当酶催化某一化学反应时，酶首先和底物结合生成中间复合物（ES），然后生成产物（P），并释放出酶。

• 酶和底物结合生成中间复合物（ES）已被电子显微镜和X射线晶体结构分析直接观察到。
• 酶促反应的动力学方程式：米氏方程
• 动力学参数的意义：

1. Km是酶的一个特征性常数，只与酶的性质有关，与酶的浓度无关。
2. Km值可以判断酶的专一性和天然底物。
3. 若已知某个酶的Km值，可以计算在某一个底物浓度时，反应速率相当于最大反应速率Vmax的百分率。
4. Km不等于Ks。某种情况下，Km的大小可以表示一个酶与底物结合的难易程度。
5. Km可以帮助推断某一反应的方向和途径。可推断连锁反应的限速步骤。可推断多酶体系中的优势途径。
6. 在一定酶浓度下，酶对特定底物的Vmax也是一个常数。同一种酶对不同底物的Vmax也不同，pH、温度和离子强度等因素也影响Vmax的数值。Kcat值越大，表示酶的催化效率越高。

5.2.2 酶促反应动力学（2）

• 利用作图法测定Km和Vmax：将米氏方程变化成相当于y=ax+b的直线方程，再用作图法求出Km。
• 双倒数作图法：实验点过分集中在直线的左下方，而低浓度S因其倒数后误差大会影响Km和Vmax的准确测定。
• Eadie-Hofstee法
• Hanes-Woolf作图法
• Eisenthal和Cornish-Bowden直接线性作图
• 多底物的酶促反应动力学
• 双底物反应：序列反应（单一置换反应），包含有序反应和随机反应；乒乓反应（双-置换反应）
• 序列反应：底物的结合和产物的释放有一定的顺序，产物不能在底物完全结合前释放。A和B两底物均结合到酶上，然后反应产生两产物P和Q。
• 有序反应：底物按照一定的顺序与酶结合（A领先底物），形成三元复合物，然后按照一定的顺序释放放一个的产物。
• 随机反应：两底物随机地与酶结合，形成三元复合物，产物的释放也是随机的。

5.2.3 酶促反应动力学（3）

• 乒乓反应：酶与领先底物A的反应产物（P）在酶与第二个底物B反应之前释放出来，结果酶E转变为一种修饰酶形式E'，然后再与底物B反应生成第二个产物Q，同时释放出未被修饰的酶E。
• 酶的抑制作用：由于酶必需基团化学性质改变，使酶的活性降低或丧失，但并不引起酶蛋白变性的作用称为抑制作用（inhibition）。
• 能够引起抑制作用的化合物则称为抑制剂（inhibitor）。
• 抑制程度表示方法：相对活力分数（残余活力分数）；相对活力百分数（残余活力百分数）；抑制分数：指被抑制而失去活力的分数；抑制百分数
• 抑制作用的类型：不可逆抑制剂（非专一性不可逆抑制剂和专一性不可逆抑制剂）；可逆抑制剂（竞争性抑制剂、非竞争性抑制剂、反竞争性抑制剂）。
• 不可逆抑制作用：抑制剂与酶蛋白中的必需基团以共价键形式结合，引起酶的永久性失活，不能用透析或超滤等物理方法除去抑制剂而恢复酶活性。
• 可逆抑制作用：抑制剂与酶蛋白以非共价键方式结合，引起酶活性降低或暂时性丧失，抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。
• 竞争性抑制：某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竞争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。
• 竞争性抑制剂通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。
• 非竞争性抑制：酶可同时与底物及抑制剂结合，即底物和抑制剂没有竞争作用。酶与抑制剂结合后，还可与底物结合；酶与底物结合后，也可再结合抑制剂，但是三元的中间产物不能进一步分解为产物，所以酶活性降低。如某些金属离子。

5.2.4 酶促反应动力学（4）

• 反竞争抑制：酶只有与底物结合后才与抑制剂结合，从而导致酶活性下降。常见与多底物反应中，在单底物反应中少见。
• 可逆抑制剂作用和不可逆抑制作用的鉴别：
• 物理方法：用透析、超滤或凝胶过滤等物理方法区别；
• 动力学方法：在测定酶活力的系统中加入一定量的抑制剂，然后测定不同酶浓度的反应初速率。
• 
• 一些重要的抑制剂
• 非专一性不可逆抑制剂：作用于酶的一类或几类基团（包括必需基团），引起酶的失活。

1. 有机磷化合物----与酶活性直接有关的丝氨酸上的-OH牢固地结合，从而抑制某些蛋白酶或酯酶。（DFP、敌百虫、敌敌畏、农药1605等）。
2. 有机汞、有机砷化合物
3. 重金属盐
4. 烷化剂
5. 氰化物、硫化物、CO

5.2.5 酶促反应动力学（5）

• 专一性不可逆抑制剂：专一地作用某一酶的活性部位的必须基团导致酶失活。分为Ks型和Kcat型两大类。

1. Ks型不可逆抑制剂：这类抑制剂与酶的底物结构类似，可以和响应的酶结合，同时还带有一个活泼的化学基团，能与酶活性中心基团反应进行化学修饰，从而抑制酶活性。因抑制是通过对酶的亲和力来对酶进行修饰标记的。亲和标记试剂。由于这类抑制剂的活泼基团也可以修饰酶分子其他部位的同一基团，因此其专一性有一定的限度。这取决于抑制剂与活性部位必需基团在反应前形成非共价络合物的解离常数以及非活性部位同类基团形成非共价络合物的解离常数之比，即Ks的比值。
2. Kcat型不可逆抑制剂：Kcat型抑制剂不但具有与天然底物类似的结构，而且本身也是酶的底物。还有一个潜伏的反应基团，当酶对这类抑制剂进行催化反应时，该潜伏基团被暴露或活化，又作用于酶活性中心的有关基团，使酶不可逆失活。即底物需经过酶催化之后，才能形成酶的不可逆抑制剂，因此，称之为“自杀式底物”。

• 在可逆抑制剂中最重要的是竞争性抑制剂。大多数竞争性抑制剂与酶催化的天然代谢物在结构上十分相似，能选择性地抑制病菌或癌细胞在代谢过程中的某些酶，而具有抗菌和抗癌作用。这类抑制剂可称为抗代谢物或代谢类似物。
• 人可利用外源叶酸，而细菌则不能。
• 过渡态类似物
• 温度对酶反应的影响：温度升高，酶促反应速度加快；达到一定温度后，再增加温度，酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。因此大多数酶有一个最适温度。在最适温度条件下，反应速度最大。
• 酶对温度的耐受与其存在状态有关。
• pH的影响：在一定的pH下，酶具有最大的催化活性，通常称此pH为最适pH。最适pH是酶特性之一。
• pH影响酶活力的原因：

1. 过酸或过碱可以使酶的空间结构破坏。引起酶构象的改变，酶活性丧失。
2. pH影响了底物的解离状态，或使底物不能与酶结合，或者结合后不能生成产物；pH影响酶分子活性部位上有关基团的解离，从而影响与底物的结合或催化，使酶活性降低；也可能影响到中间络合物ES的解离状态，不利于催化生成产物。
3. pH影响维持酶分子空间结构的有关基团解离，从而影响了酶活性部位的构象，进而影响酶的活性。

• 由于酶活力受pH的影响很大，因此在酶的分离纯化时要选择酶的稳定pH，通常在某一pH缓冲液中进行。
• 激活剂对酶反应速度的影响:
• 凡能提高酶活性的物质，都称为激活剂（activator）。

1. 无机离子：金属离子、阴离子
2. 小分子有机化合物：某些还原剂、乙二胺四乙酸
3. 某些酶类：酶原激活过程中的酶类