一文搞懂RNA-seq的链特异性测序和非链特异性测序

RNA-seq 实验构建文库时，可以构建非链特异性文库和链特异性文库：

• 非链特异性文库：无法区分打碎的片段转录自正义链还是反义链。
  

• 链特异性文库：建库时保留了转录本的方向信息用以区分转录本来源，避免互补链干扰。

1. 测序方法

两种建库方法对应两种测序方法：

• 非链特异性测序方法（non-stranded RNA-seq protocol）：得到的reads没有方向性，无法判断reads是属于Gene A还是属于Gene B (Antisense RNA)的。

• 链特异性测序方法（stranded RNA-seq protocol）：得到的reads具有方向，可以根据reads方向判断reads是属于Gene A还是属于Gene B。

• 非链特异性测序方法

测序得到的reads1.fastq和reads2.fastq没有方向性，因此我们将mapping到Gene A的所有reads都归为Gene A的reads。

• 链特异性测序方法

链特异性测序方法根据reads1.fastq的方向性又分为forward和reverse两种。

2. 计数 Reads

3. 判断测序方法

为了准确的计算出每个基因的mapped reads，我们需要知道测序方法的方向性。主要有以下途径。

• 资料参考：当明确知道测序方法，可以通过经验或查阅资料得知不同测序方法的方向性。

• 软件判别：当数据测序方法未知时，我们可以通过RseQC软件中的infer_experiment.py脚本判断测序方法的方向性。

参考文献

1. https://book.ncrnalab.org/teaching/part-iii.-ngs-data-analyses/2.rna-seq/2.1.expression-matrix

2. Comparison of stranded and non-stranded RNA-seq transcriptome profiling and investigation of gene overlap

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