二代测序数据质量评估软件FastQC的安装及使用说明
标签：_生信工具, _测序数据质控及评估
二代测序数据质量评估软件FastQC的安装及使用说明
当我们拿到二代测序数据后，第一件事肯定就是要查看一下测序质量的好坏了，以评估该测序数据是否满能够进行后续的生信分析。
这里介绍一款常用的二代测序数据质量评估软件，FastQC。该软件使用Java编写，可以快速多线程地对测序数据进行质量评估。并最终生成一份评估报告，包含多项内容，如测序reads碱基质量、GC含量、reads长度、k-mer分布等信息，以便我们快速得知测序数据质量。
注：目前在较新的FastQC版本中，添加了对三代PacBio、三代Nanopore测序数据的质量评估功能，使得FastQC不再仅限于对二代测序数据的评估。但在本篇只演示其在二代测序中的质控评估过程（因为我也没尝试过使用它评估三代数据，不知效果如何）。
FastQC官方网站：http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
本文中的测试数据以及结果示例等的百度盘链接如下，均无提取码（若失效请在下方留言）。
测试fastq数据：https://pan.baidu.com/s/1yYQNxty5hBdcpoA8xkrQUg
FastQC结果文件示例：https://pan.baidu.com/s/1Z9vqsCaDeXWrz9pN8WeSjQ
FastQC下载安装
在Linux系统下，我们可以既可以通过conda直接安装，也可以在官网中下载可执行程序直接使用，二者选一即可，都挺方便的。
一，可直接使用conda安装。
#安装
conda install fastqc
二，在官网中找到下载链接下载。下载后给“fastqc”主程序添加可执行权限即可使用，无需编译。
#在 Linux 系统中，解压后，给主程序添加可执行权限即可使用
unzip fastqc_v0.11.8.zip && cd FastQC
chmod +x fastqc
使用FastQC评估二代测序reads数据（fastq格式）
我们首先看一下FastQC程序的各项参数。
fastqc -h
其中，在二代测序数据评估中的常用参数选项说明：
-o，结果输出路径；
--extract，默认情况下，会将所有结果文件打包后生成一个压缩文件，该参数存在时将解压缩；
-t，程序运行时的线程数；
-c，指定一个文件，该文件内容为“name[tab]sequence”样式，记录可能的污染序列， FastQC会根据该文件中的序列信息评估测序数据的污染程度，不指定时不评估；
-a，指定一个文件，该文件内容为“name[tab]sequence”样式，记录测序接头序列，FastQC会根据该文件中的序列信息评估测序接头序列的残留情况，不指定时将自动识别通用接头序列；
-k，指定k-mer统计时的k-mer长度，取值范围2-10，默认7；
-q，默认情况下，程序会实时报告运行的状况，该参数存在时仅报告错误信息。
然后我们使用FastQC，对网盘中所提供的测试数据进行评估。
测试数据中，包含了二代测序原始下机数据raw reads以及经过质控后的clean reads，我们对这些都进行评估，以查看质控前后的数据质量。
FastQC识别fastq格式，也识别gzip压缩后的fastq格式，两种格式的二代测序数据均可作为输入文件。一般情况下，指定输出路径（这里直接输出在当前路径下）及线程数后，其它使用默认参数即可。
#评估测试数据（一般使用默认参数即可）
#fastqc [options] [data]
fastqc -o ./ -t 4 Bacillus_subtilis.raw_R1.fastq.gz
fastqc -o ./ -t 4 Bacillus_subtilis.raw_R2.fastq.gz
fastqc -o ./ -t 4 Bacillus_subtilis.clean_R1.fastq.gz
fastqc -o ./ -t 4 Bacillus_subtilis.clean_R2.fastq.gz
程序运行完毕后，对于每个测序数据，得到两个结果文件，“*.zip”以及“*.html”。其中，“*.html”即为FastQC所得评估报告，主要关注这份报告即可；“*.zip”为打包压缩后的结果文件，其中包含了“*.html”，以及一些统计结果、图片结果等信息。本次运行的所有结果均已保存在网盘中，若需要可查看。
此外，也可在FastQC官网中，点击这些链接查看官方所给定的示例评估报告，包含了更多种的测序类型。
FastQC网页报告内容解读
此处我们继续使用上述运行结果文件中的“Bacillus_subtilis.clean_R1_fastqc.html”来进行内容展示。
Summary
Summary简要展示出哪些指标评估质量良好（PASS，绿色√），哪些指标评估质量一般（WARN，橙色！），哪些指标评估质量较差（FAIL，红色×）。绿色√越多表明测序数据质量越佳。对于红色×部分，需重点关注并探其原因。
在本示例中，我们可知测序数据“Bacillus_subtilis.clean_R1.fastq.gz”的测序质量良好。
接下来查看各详细评估指标。
Basic Statics
Basic Statics中统计了测序数据类型、测序平台、测序数据中包含的总reads数、测序reads长度范围及测序reads的平均GC含量等信息。
Per base sequence quality
Per base sequence quality，以箱线图的形式展示了测序reads沿5’到3’方向所有碱基的测序质量值的分布。图中，横坐标为碱基在reads中的位置，纵坐标为单碱基错误率Q，其中Q = -10*log10（error P）即20表示1%的错误率，30表示0.1%。
根据测序技术的特点，测序片段末端的碱基质量一般会比前端的低，属正常现象。若reads末端测序质量明显较差，可考虑将末端碱基统一裁剪去除。
若任一位置的下四分位数低于10或中位数低于25，报“WARN”；若任一位置的下四分位数低于5或中位数低于20，报“FAIL”。
在本示例中，我们可见测序数据“Bacillus_subtilis.clean_R1.fastq.gz”中的碱基质量几乎全部集中在高质量区域（绿色区域），表明该数据测序质量良好。
Per tile sequence quality
Per tile sequence quality，每个tail测序情况，横轴表示碱基位置，纵轴表示tail的index编号。这个图主要是为了防止在测序过程中某些tail受到不可控因素的影响而出现测序质量偏低，蓝色表示测序质量很高，暖色表示测序质量不高。当某些tail出现暖色，在后续的分析种把该tail测序结果全部去除。
在本示例中，我们可知测序数据“Bacillus_subtilis.clean_R1.fastq.gz”的测序质量良好。
Per sequence quality scores
Per sequence quality scores，横轴为reads碱基平均质量值，纵轴是reads数目。若测序质量越高，则绝大多数reads分布在高质量值区域，即曲线峰值的横坐标对应在高分区。
当峰值横坐标小于27（错误率0.2%）时报“WARN”，当峰值横坐标小于20（错误率1%）时报“FAIL”。
在本示例中，我们可见测序数据“Bacillus_subtilis.clean_R1.fastq.gz”中，reads碱基平均质量值集中分布在高质量区域，即峰值的横坐标在36的位置，表明该测序数据质量良好。
Per base sequence content
Per base sequence content，统计了测序碱基A、T、C、G的含量分布，可以一定程度上反映测序是否正常。图中横坐标为碱基在reads中的位置，纵坐标为该位置处各碱基含量百分比，根据碱基互补原则，A和T的比例应该接近，C和G的比例也应该是接近的。
实验过程所用的随机引物会引起前几个位置的碱基组成出现波动，这属于正常情况，或者可考虑将5'端前几个位置处的碱基统一裁剪去除。
当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过10%，报“WARN”；当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过20%，报“FAIL”。
在本示例中，我们可见测序数据“Bacillus_subtilis.clean_R1.fastq.gz”中，A、T、C、G四种碱基的含量稳定（报“WARN”是因为起始位置的碱基出现波动所致），表明该测序数据质量良好。
Per sequence GC content
Per sequence GC content，展示了测序reads的GC含量分布。图中横坐标为reads GC含量，纵坐标为reads数量；蓝色曲线为理想状态下的GC含量曲线（显著单峰），红色曲线为实际的GC含量曲线。
若红色曲线与蓝色曲线的拟合程度越高，则测数据序质量越好。曲线形状的偏差往往是由于文库的污染或是部分reads构成的子集有偏差（overrepresented reads），形状接近正态但偏离理论分布的情况提示我们可能有系统偏差，当红色出现双峰是表示混入了其它DNA序列。
偏离理论分布的reads超过15%时，报“WARN”；偏离理论分布的reads超过30%时，报“FAIL”。
在本示例中，我们可见测序数据“Bacillus_subtilis.clean_R1.fastq.gz”的GC曲线显著单峰，且几乎完全与理论曲线相吻合，表明该测序数据质量良好。
Per base N content
Per base N content，当出现测序仪不能分辨的碱基时会产生N，该图统计了N碱基的含量分布。图中横坐标为碱基在reads中的位置，纵坐标为该位置处N碱基含量百分比，N碱基含量越低越好。
当任一位置N的比率超过5%报“WARN”，超过20%报“FAIL”。
在本示例中，我们可见测序数据“Bacillus_subtilis.clean_R1.fastq.gz”中几乎不含有N碱基，即测序质量良好。
Sequence Length Distribution
Sequence Length Distribution，统计了测序reads的长度分布，图中横坐标为reads长度，纵坐标是reads数目。
对于测序原始raw reads，每次测序仪测出来的长度在理论上应该是完全相等的；对于质控后的clean reads，由于切除测序接头、低质量碱基等后会导致长度出现波动，但就“好的测序数据”来讲，reads长度分布仍然集中在最长区域。
当reads长度不一致时报“WARN”；当有长度为0的read时报“FAIL”。
在本示例中，“Bacillus_subtilis.clean_R1.fastq.gz”为clean reads数据，其reads长度集中分布在147-150nt的位置几乎与测序读长一致（illumina PE150测序，raw reads全长150nt），且未见明显的小片段reads，表明测序数据质量良好。此处报“WARN”是由于reads长度不一致（clean reads长度不一，完全属正常现象）。
Sequence Duplication Levels
Sequence Duplication Levels，统计序列完全一致的reads的频率，判定为duplication reads（重复序列），由二代测序过程中PCR的偏好性扩增导致。一般测序深度越高，越容易产生一定程度的duplication reads，属于正常现象。图中，横坐标表示duplication的次数，纵坐标表示duplication reads的数目。理论上，duplication reads的比例越低越好。
当测序数据量很大时，使用全部数据计算duplication reads将相当费时，此时FastQC会选取数据中前200000条reads统计其在全部数据中的duplication reads情况，同时重复数目大于等于10的reads被合并统计。由于reads越长越不容易完全相同（由测序错误导致），所以其重复程度仍有可能被低估。
当duplication reads占总数的比例大于20%时，报“WARN”；当duplication reads占总数的比例大于50%时，报“FAIL”。
在本示例中，我们可见测序数据“Bacillus_subtilis.clean_R1.fastq.gz”中，duplication reads占总数的比例低于20%，表明测序数据质量良好。
Overrepresented sequences
Overrepresented sequences，如果有某个序列大量出现，就称其为overrepresented read，该值越低越好。
同上述duplication reads，当测序数据量很大时，使用全部数据计算overrepresented read将相当费时，此时FastQC会选取数据中前200000条reads统计其在全部数据中的overrepresented read情况，因此可能会存在有的overrepresented read被忽略。
当overrepresented read超过总reads数的0.1%时报“WARN”，超过1%时报“FAIL”。
在本示例中，对于测序数据“Bacillus_subtilis.clean_R1.fastq.gz”而言，未检测到overrepresented read，表明该数据测序质量良好。
Adapter Content
Adapter Content，统计测序reads两端接头序列（adapter sequence）长度所占比例，图中横坐标为碱基在reads中的位置，纵坐标表示该位置的碱基为测序接头序列碱基的百分比。
对于raw reads来讲，会存在一定比例的测序接头序列，需要过滤去除；而对于clean reads来讲，理论上测序接头序列应当已经被过滤干净。
在本示例中，“Bacillus_subtilis.clean_R1.fastq.gz”为clean reads数据，我们可见其接头序列已被完全过滤干净。
Kmer Content
Kmer Content，出现频率总体上3倍于期望或是在某位置上5倍于期望的k-mer被认为是overrepresented k-mers。fastqc除了列出所有overrepresented k-mers，还会把前6个的per base distribution画出来。
当有出现频率总体上3倍于期望或是在某位置上5倍于期望的k-mer时，报“WARN”；当有出现频率在某位置上10倍于期望的k-mer时报“FAIL”。
在本示例中，对于测序数据“Bacillus_subtilis.clean_R1.fastq.gz”而言，未检测到overrepresented k-mers，表明该数据测序质量良好。
参考文献
Patel R K, Jain M. NGS QC Toolkit: a toolkit for quality control of next generation sequencing data. Plos One, 2012, 7(2):e30619.