重组片段抗体表达介绍-泰克生物

一．抗体片段

每一个完整的免疫球蛋白（IgG）分子包含通过二硫键连接的两条重链和两条轻链。抗体片段（如Fab、scFv和VHH）体积小，比其全长抗体具有更好的组织或肿瘤穿透力。因此，它们在免疫治疗方面具有巨大的前景，尤其是在实体瘤方面。此外，它们的半衰期也较短，可用作放射性显像剂。然而，由于缺乏Fc区，它们不能引起Fc介导的抗体效应功能，如抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDC）。

二．抗体Fab片段

2.1 Fab片段结构

Fab片段（Antigen-binding fragment）又叫做抗原结合片段，是抗体结构中可以与抗原结合的区域。其由完整的轻链（可变区和恒定区）和部分重链结构（可变区和一个恒定区片段）组成，轻链与重链通过一个二硫键连接，体积较小，分子量为47-48 kDa。

2.2 Fab抗体的制备

（1）酶解法：Fab可以通过在单抗的基础上直接通过酶切获得，酶解法通常用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等酶对人免疫球蛋白G进行降解，得到F(ab')2，Fab，Fc片段等产物。这种方式优点是快速简单，但劣势也很明显，首先是需要单抗原料，一般数量有限且价格昂贵，另一方面，即使优化了全抗体的酶促切割后，得到的Fab往往会损失一定的免疫反应性。

（2）利用表达系统制备：重组Fab的优势比较明显，由于不具备Fc区，从而不需要翻译后修饰和糖基化，可以同时在原核和哺乳动物系统中表达。利用表达系统生产Fab片段，通常利用大肠杆菌表达系统与哺乳动物表达系统。大肠杆菌表达系统具有生产成本低、生产速度快等优点，但容易形成包涵体，复性后活性难保证。

（3）Fab抗体文库：利用噬菌体展示技术，先制备Fab片段抗体库，在经过数轮的筛选富集，即可得到高亲和性的Fab抗体。理论上，小鼠B细胞抗体库小于10^8，人的B细胞抗体库小于10^12。而Fab组合抗体库可以达到10^10-10^13的级别，增加了筛选到理想抗体的可能性。

三．ScFv简介

ScFv抗体包含重链可变区（Variable heavy chain, VH）和轻链可变区（Variable light chain, VL），在两个可变区之间通过人工合成一种灵活的肽连接物将其连接，这种肽连接物在E.coil（大肠杆菌）中很容易表达，所以我们可以使用蛋白质工程来改善ScFv，如提高亲和性或改变其特异性。

3.1 噬菌体展示技术表达ScFv

从免疫得到的脾脏B细胞中提取总mRNA，通过逆转录得到cDNA，再通过特定的引物以cDNA作为模板扩增出轻链可变区和重链可变区DNA，再通过重叠PCR将轻链可变区和重链可变区通过Linker连接，得到总的ScFv基因，将ScFv 基因连接到pIT2噬菌体载体（含抗性基因），再转化到大肠杆菌（Ecoli TG1）中，这样一个ScFv库就初步建成了。再将含有ScFv库的Ecoli TG1与KM13辅助噬菌体共培养，使ScFv 展示在噬菌体表面，最终通过收集噬菌体颗粒扩大ScFv基因库。通过对目的ScFv噬菌体颗粒富集筛选得到产物并送去测序。

3.2 单链抗体的纯化

单链抗体缺乏在完整抗体中含有的Fc片段，因此普通的结合位点（Protein G）不能用来纯化抗体。通常，在scFv片段的C端加上HIS-tag，然后利用金属螯合亲和层析Ni-TED Purose 6 Fast Flow可以对单链抗体进行纯化。

 

四．纳米抗体（VHH）

纳米抗体（VHH）与普通抗体VH具有相同的结构域，即4个保守框架区（FR1/2/3/4）和3个互补决定区（CDR1/2/3）。普通抗体的VH中FR2内有四个高度保守的疏水性氨基酸残基（V42、G49、L50和W52），而在VHH抗体中，这四个氨基酸被替换成亲水性的氨基酸残基（F42或 Y42、E49、R50和G52），因此增加了纳米抗体的水溶性。

五．抗体片段的优点

（1）减少了Fc相互作用导致的非特异性结合（许多细胞具有结合 Fc 区的受体）；

（2）在免疫沉淀和蛋白质印迹实验中，控制Fc与蛋白A或蛋白G结合；

（3）更有效地穿透组织切片，改善免疫组织化学（IHC）染色；

（4）减少大蛋白质表位的位阻，固相应用中抗原检测的灵敏度可能更高；

（5）消除抗原抗体结合研究中与Fc相关的效应功能（例如补体固定）；

（6）利用X射线晶体学或NMR来研究免疫识别结构区，操作更简便；

（7）内源实验时的免疫原性低于完整抗体。