哺乳动物细胞培养FAQ
哺乳动物细胞培养FAQ
一、原代细胞和细胞系之间有什么区别？
原代细胞是直接来源于人类或动物组织的细胞。原代细胞的寿命通常是有限的。与细胞系相比，原代细胞保留了供体的许多特征和标记，可用于建立更好的疾病模型。
细胞系的细胞经历了持续很长时间的传代，一般已发生遗传转化。一个细胞系通常可以传代30-80代，与原代细胞相比，细胞系已经失去了它们从中分离出来的原始组织的真实特征。但因为它们易于处理并有广泛发表的文献支持，人们为了方便起见还是更倾向于使用这些细胞系。
二、如何正确选择培养基种类[1]？
通常认为首选MEM做贴壁细胞培养，RPMI-1640做悬浮细胞培养，但对于原代培养来说，培养基的选择是一个非常关键的问题。在这种情况下，理论上应该关注细胞类型、营养需求、该类型细胞在体内生长的需求以及这些最佳组合是否有现成的产品可用。实际上，在原代培养中不仅应该尝试不同种类的培养基，而且在某些情况下，可能还需要尝试某种培养基的特定类型，如DMEM+非必需氨基酸+谷氨酰胺或DMEM w/o L-谷氨酰胺，但含有非必需氨基酸。这完全取决于特定类型的细胞所需的营养类型和从中分离出来的微环境。有时HAM’s F-12和其他营养成分也是必需的。不同细胞所需的营养成分不同，它可以是肝细胞的HGF，神经细胞的RA（视黄酸）等等，因此在特定的细胞类型的情况下，我们需要换用不同的培养基。
此外，还需要考虑细胞的下游应用。例如，如果使用细胞系进行荧光分析，则需要从培养基中排除酚红，因为它具有高荧光，可导致背景读数过高。
三、为什么需要使用血清？
血清通常作为添加物，以2-20%的比例添加到培养基中，为细胞提供综合营养、激素、生长和附着因子等。血清还可以作为细胞培养系统的缓冲液，避免各种因素（包括pH变化、蛋白水解活性或重金属、内毒素等）干扰细胞生长或产生毒性作用。
虽然使用血清会带来一些问题，比如批次差异、成分不明、干扰下游纯化等，目前也确实有许多运用无血清培养的场景，但血清始终在细胞培养中拥有一席之地。
四、牛血清为什么要分胎牛、新生牛、小牛？如何选择[2]？
牛血清多为畜牧业的副产品，胎牛血清（FBS）、新生牛血清或小牛血清的区别源于不同的采血时间，或者说牛龄。
胎牛血清是通过对未出生的胎牛（3-8月龄）进行心脏穿刺取血而获得的，新生牛血清则是对出生后12-24h的新生牛静脉采血而得，小牛血清是对16-22周龄的小牛进行动脉采血收集。虽然对新生牛或小牛的年龄划分可能有所不同，但可以确定的是牛龄越小，血清中所含的促细胞生长因子、促贴附因子、激素及其他活性物质等组份的比例就越高，而抗体的水平就越低。
FBS在生化成分上的优势使其被认为是血清的金标准，因此价格也是最高的。选择血清通常是基于细胞类型和培养成本的综合考虑。对于娇贵难养的细胞，只能选择胎牛血清，而一些容易培养的肿瘤细胞系和常规细胞系可以考虑新生牛或小牛血清。
五、细胞培养中出现黑点是污染吗？如何预防和处理[3]？
首先，用肉眼观察培养基是否混浊。如果混浊，基本上可以确认为污染。如果没有，在显微镜下观察黑点的大小和形状是否规则，它们是否在移动，它们是否在做布朗运动，或者是直线型快速移动。如果黑点大小不规则，并执行布朗运动，则可能是细胞碎片（细胞状况不佳或消化过度）。血清反复冻融后的蛋白质沉淀以及细胞代谢物也可能形成黑点。如果黑点大小相同且移动迅速，则可能是细菌污染。
预防措施：
1） 把握细胞传代的最佳时间，而不是细胞衰老的时候。
2） 掌握消化时间，防止细胞碎片过度消化。
3） 减少血清和其他试剂的反复冻融。调整培养基的pH值至最佳。
4） 严格控制水和器具的清洁。
处理方法：如果确定黑点为污染物，请及时处理细胞并丢弃。如果在镜下观察细胞，生长状态良好，与黑点出现前相比，没有任何变化，可以不处理，也可参考以下方法进行处理。
1）悬浮细胞：通过缓慢离心（500-600 rpm/min，5-6 min）收集细胞上清液，并更换为新的培养瓶。
2）贴壁细胞：用PBS清洗细胞2-3次。清洗时，轻轻敲打培养瓶，去除附着不牢固的碎片和颗粒。然后丢弃PBS并添加低浓度胰蛋白酶（例如0.05%，1分钟）进行消化，使细胞间隙中的颗粒和碎屑脱落。去除低浓度胰蛋白酶，然后正常消化细胞。以低速（500-600rpm/min，5-6min）离心收集的细胞悬浮液，并用新的培养瓶更换培养瓶。适当增加血清浓度进行培养。
六、细菌污染有什么症状？如何处理[4]？
细菌污染是细胞培养中最常见的污染，主要由操作不慎或使用了灭菌不完全的耗材与试剂引入。培养中的细菌污染一般通过目测到培养基变浊而被发现。好氧菌增殖分裂迅速，感染24h内即可使培养基浑浊；厌氧菌在常规细胞培养条件下增殖缓慢，需要较长时间才会观察到浑浊现象。
最常见的有枯草杆菌、大肠杆菌、假单胞菌及白色葡萄球菌。镜下形态则为长杆状、短杆状和颗粒状等。发生杆菌污染时，如菌量较少，培养基可保持澄清，镜下一般可见杆菌沿轴向快速游动。如为颗粒状污染，一般培养基会浑浊或有白色沙状沉淀。
污染处理：一般如果不是非常珍贵的培养物，建议直接丢弃处理，重新复苏细胞培养。在细胞活力尚保持较好的情况下，可先用PBS清洗细胞，再尝试加抗生素进行挽救。由于国内细胞培养中抗生素使用泛滥，所以出现污染后加双抗（青、链霉素）一般没有效果。杆菌可选用100μg/ml庆大霉素处理一周，颗粒状细菌可用25μg/ml环丙沙星处理一周，效果相对还不错。
七、发生真菌污染如何处理[4]？
细胞培养中最常见的污染真菌有：烟曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌等。霉菌污染肉眼可见菌丝生长，酵母污染在镜下可以看到明显的出芽形态。
污染处理：如果不是非常珍贵的培养物，建议尽早丢弃处理，并及时对培养箱和相关环节进行加强消毒处理。如果是细胞培养板单孔或几孔污染，可小心吸除后加高浓度氢氧化钠封闭，避免污染扩大，累及其他孔或培养瓶中细胞。如需尝试挽救，可用两性霉素B进行处理。注意两性霉素毒性较大，需要在细胞有50%以上且状态没受大影响前处理。
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