PrimerDesign使用总结

本文并非教程，只是总结一下日常学习的经验。因为本人也是小白，难免会有错误，欢迎各位交流指正。

https://github.com/zichner/primerDesign
大体教程作者已经在github中介绍了，但在按照教程跑流程的时候还是出了一些问题，所以简单总结一下。
PrimerDesign的介绍在github链接中有，简单来说就是设计引物的。
PrimerDesign分为Docker版和Python版，我用的是Python版（别问，问就是不会用Docker...）。

Python版流程

1. 需要安装ncbi-blast和primer3

ncbi-blast: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST
（复制粘贴或者github里有链接，我也不知道为啥打不开）
我用的是Mac，所以下的是dmg文件，安装比较简单。
但我觉得有必要讲一下的是，makeblastdb的位置在

/usr/local/ncbi/blast/bin/makeblastdb

（为什么讲这个，因为我没找到。。。）

使用makeblastdb格式化数据库，

makeblastdb -in REF_GENOME.fa -dbtype nucl -parse_seqids

REF_GENOME.fa是你的参考基因组文件。

primer3: http://sourceforge.net/projects/primer3/files/primer3

2. 需要设置config文件

这个应该是重中之重，因为作者在github中基本没有提到config文件相关的内容。从github下载下来的文件中有四个config示例文件，直接拿来运行的话会报错，因此我们需要修改里面的一些参数。

[General]
# Location of reference genome BLAST database
reference_genome = /Users/.../primerDesign/reference.fa //参考基因组的路径

[Primer3]
//省略中间内容
# Path to Primer3 configuration files
PRIMER_THERMODYNAMIC_PARAMETERS_PATH=/Users/.../primer3-2.4.0/src/primer3_config/  
//我把中间路径省略了
//这是primer_config文件夹的路径，在primer3中

[Programs]
# Path to executables unless $PATH includes them
primer3    = /Users/.../primer3-2.4.0/src/primer3_core //primer3_core的路径，在primer3中
blast      = /usr/local/ncbi/blast/bin/blastn //blastn的路径
blastdbcmd = /usr/local/ncbi/blast/bin/blastdbcmd //blastdbcmd的路径

3. 输入文件

1    1000000    .    1000100    del    id1

第1列：起始染色体号；
第2列：起始位点；
第3列：终止染色体号，只针对translocation，其他类型填"."。
第4列：终止位点；
第5列：变异类型；
第6列：注释，没有就填".";

4. 运行命令

python primerDesign.py primerDesign_22bp_relaxed.cfg exampleVariants.txt result

5. 结果

会产生两部分内容（在一个文件里），第一部分是至少有一个unique primer，第二部分是两个都是unique primer。
unique的意思是这个primer在整个基因组中只有一个target。

##第一部分
1    1000000    .    1000100    del    id1    2.411367    AGGTCACGCACATCATGACTCA    CAGACCACACCACACCCCTC    True    False    61.986    62.397    247    146    True    True    999753    1000246    393    493

#第二部分
1    1000000    .    1000100    del    id1    0.156586    AGGTCACGCACATCATGACTCA    ACCTGCATCTAAGCTTAGGGCC    True    True    61.986    62.143    247    618    True    False    999753    1000718    865    965

前6列：和输入文件相同；
第7列：Primer3 quality；
第8、9列：Primer1 和Primer2的序列；
第10、11列：Primer1和Primer2是否unique；
第12、13列：Primer1和Primer2的Tm值；
第14、15列：Primer1和Primer2与Breakpoint的距离；
第16、17列：Primer1和Primer2是否可被测序；
第18、19列：Primer1和Primer2的坐标；
第20、21列：Variant和Reference预期的条带大小；

最后根据自己的需要进行选择。
如有错误，欢迎指正。