从零开始学PCR技术（一）：PCR技术简介

PCR 可能是分子生物学中使用最广泛的技术。虽然我本科学的是生物科学，提过 DNA，也跑过 PCR，但现在都快忘了 PCR 的步骤是三个还是四个了。赶快网络搜索之，整理成一个从零开始学系列。

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一项利用 DNA 双链复制原理，在生物体外复制特定 DNA 片段的的核酸合成技术。可在短时间内大量扩增目的 DNA 片段，而不必依赖大肠杆菌或酵母菌等生物体。

DNA 的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链 DNA 在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在 DNA 聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA 在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制 DNA 的变性和复性，加入设计引物，DNA 聚合酶，dNTP 就可以完成特定基因的体外复制，这是 PCR 的理论基础。

一、反应体系

PCR 反应是在体外模拟 DNA 的复制过程，因此反应体系中必须具有 DNA 复制所需的基本要素：

1. 模板（template），含有需要扩增的 DNA 片段。

2. 引物（primer），一对引物决定了需要扩增的起始和终止位置。

3. 聚合酶（polymerase ），DNA 聚合酶复制需要扩增的区域。

4. 脱氧核苷三磷酸（dNTP），用于构造新的互补链。

5. 缓冲液（buffer），提供适合聚合酶行使功能的化学环境。

二、反应步骤

标准 PCR 过程分为三步：

1. 变性（Denaturation）：利用高温使 DNA 双链分离。DNA 双链之间的氢键在高温下（93 - 98℃）被打断。

2. 退火（Annealing）：在 DNA 双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链 DNA 上。

3. 延伸（Extension）：DNA 聚合酶由降温时结合上的引物处开始沿着 DNA 链合成互补链。延伸完成，则完成一轮循环，DNA 片段数增加一倍。往复循环这三个步骤 25-35 次，DNA 片段数将得到指数级增加。

聚合酶链式反应简图

三、结果检测

PCR 反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳是最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。

四、技术特点

1. 灵敏度高

   PCR 产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg = 10^-12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=-6）水平。能从 100 万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR 的灵敏度可达 3 个 RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为 3 个细菌。

2. 特异性强

   PCR 反应的特异性决定因素：

• 引物与模板 DNA 特异正确的结合；

• 碱基配对原则；

• Taq 聚合酶合成反应的忠实性；

• 靶基因的特异性与保守性。

• 简便、快速

  只需要一次性将反应液加好后，就可以进行扩增。一般 2~4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。

• 纯度要求低

  不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及 RNA 均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗漱液、毛发、细胞、活组织等 DNA 扩增检测。

• 五、发展历史

  1971 年，Khorana 等最早提出核酸体外扩增的设想：经 DNA 变性，与合适的引物杂交，用 DNA 聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成 tRNA 基因。但由于当时基因序列分析方法尚未成熟，热稳定 DNA 聚合酶尚未报道以及引物合成困难，这种想法似乎没有实际意义。

  1983 年，Kary Mullis 首先提出设想。

  1985 年，Kary Mullis 在 Cetus 公司工作期间，发明了 PCR，即简易 DNA 扩增法。

  1985 年 10 月 25 日申请了 PCR 的专利，1987 年 7 月 28 日批准，Mullis 是第一发明人。

  1985 年 12 月 20 日在 Science 杂志上发表了第一篇 PCR 学术论文，Mullis 是共同作者。

  1986 年 5 月，Mullis 在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习 PCR 的方法。

  1988 年，Saiki 等将 Taq DNA 聚合酶用于 PCR 技术，成功完成了 DNA 的自动扩增。

  1993 年 10 月，Kary Mullis 获得了诺贝尔化学奖。

  从 PCR 技术发明至今已过 30 年，技术迭代已到第三代，在过去的 30 年里 PCR 技术为生命科学的发展做出了不可磨灭的贡献。

  一代 PCR

  第一代 PCR 技术就是最初的 PCR，采用普通 PCR 扩增仪来对靶基因进行扩增，然后采用琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测，只能做定性分析。

  1. 技术应用

  能将微量的 DNA 大幅增加。因此对化石中的古生物残骸，犯罪现场的毛发、皮肤碎屑或血液，只要能分离出一丁点的 DNA，就能用 PCR 加以放大，进行比对。

  2. 技术优势

  灵敏度高，特异性强，简单快捷，对样品的纯度要求低等。

  3. 技术缺点

  • 最初的 PCR 技术所采用的核酸染料，会对实验人员和环境造成伤害

  • PCR 完成之后需要开盖检测，容易发生污染造成假阳性结果

  • 检测耗时长，操作麻烦，容易出错

  • 只能做定性检测

  二代 PCR

  第二代 PCR 就是荧光定量 PCR 技术（Real-Time PCR），也叫做 qPCR。荧光定量 PCR 通过在反应体系中加入能够指示反映进程的荧光探针，通过荧光信号的积累来监测扩增产物的积累。通过荧光曲线来判断结果，并可以借助 Cq 值和标准曲线来定量。

  1. 技术应用

  用于传染性疾病病原体检测，疾病耐药基因研究，药物疗效考核，遗传疾病诊断。

  2. 技术优势

  • 污染风险低

  • 操作流程更简单、经济高效

  • 需要的 DNA 和 RNA 加样量少

  3. 技术缺点

  • 不同厂家生产的试剂和设备所产生的 Cq 值之间存在一定的差异，并不具备可比性

  • 存在背景值的影响，结果易产生偏差

  • 对于低拷贝的 DNA 往往难以检测

  • 当反应体系中有 PCR 抑制物存在时，常规的 PCR 体系经常会受到影响

  三代 PCR

  第三代 PCR 技术叫做数字 PCR（Digital PCR, dPCR, Dig-PCR），这是目前全新的一种 PCR 检测方式，能对核酸进行检测和定量，采用直接计数目标分子而不依赖任何校准物或者外标，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。

  1. 技术应用

  用于大量正常细胞群中检测少数含突变的细胞。通过稀释样品 DNA 到对应的检测孔中，经过 PCR 扩增之后，向每个孔里加入特异性荧光探针与产物杂交，然后直接计数样本中突变型和野生型等位子的数量。

  主要应用于突变分析、等位基因缺失、混杂 DNA 的癌症检测等等。

  2. 技术优势

  • 灵敏度更高

    数字 PCR 将传统的 PCR 反应分割成了数万个体系，这些体系独立扩增，独立检测，保证了个位数的模板数量都可以被检测到。

  • 定量更准确

    数字 PCR 通过微体系的荧光计数，直接将反应初始模板数量统计出来，即使某些微滴中的模板数量不止一个，也可以通过泊松分布进行计算。

  • 抗干扰能力更强

    数字 PCR 第一步反应体系的分配过程中，会将模板和抑制物分配到不同的体系，降低抑制物的干扰。并且，与 qPCR 不同的是，dPCR 检测的是终点荧光，即使微体系稍微受到了影响，也不会影响最终结果的判读。

  3. 技术缺点

  • 模板质量要求较高

    由于数字 PCR 将反应拆分成了数万个独立体系，因此其对模板量有比较高的要求，模板量超过微体系量会导致无法定量，过少会导致信号过低，降低定量准确度。

  • 非特异性产物的判断

    数字 PCR 观测的是每个体系中的终点荧光，无论 PCR 产物是否是特异性产物，只要荧光信号足够强，也是会判读为阳性结果。因此 dPCR 的引物特异性要求极高。

  PCR 各种延伸技术

  • 递减 PCR（touchdown PCR）：前几循环温度逐渐下降。

  • 逆转录 PCR（RT-PCR）：以由mRNA逆转录而来的 cDNA 为模板，也因为是从表现型基因来进行增量的，由此产生出来的 cDNA 产物不带有内含子（基因中不具意义的段落），常应用于分子克隆技术。

  • 热启动 PCR（hot start PCR）：以高热激活型核酸聚合酶进行反应，减少非专一性产物。

  • 即时 PCR（real-time PCR）：PCR 过程中利用萤光探针或染料定量检测，又称定量 PCR（quantitative PCR），可以进行多组对比。

  • 巢式 PCR（nested PCR）：先用低特异性引物扩增几个循环以增加模板数量，再用高特异性引物扩增。

  • 多重 PCR（multiplex PCR）：在同一个管中使用多组引物。

  • 复原条件 PCR（reconditioning PCR）：PCR 产物稀释 10 倍后重新放入原浓度的引物和 dNTP 等循环 3 次，以消除产物中的异二聚体。

  • dsRNA 合成（dsRNA replicator）：合并使用 high-fidelity DNA polymersae、T7RNA 聚合酶与 Phi6 RNA replicase；从双股 DNA 转录为对应的双股 RNA（dsRNA）。可应用于RNAi实验操作。

  • COLD-PCR (co-amplification at lower denaturation temperature-PCR):用以检测突变或特殊等位基因的 PCR 应用技术。

  • Digital-PCR：将标准的 PCR 反应分割至每一个反应中仅 1~2 个 copy。藉以侦测微小比例的基因差异。应用于：癌症突变基因、病原体检测、借由母血对胎儿做产前检测。

  六、应用

  感染性疾病

  PCR 在医学检验中最有价值的应用领域就是对感染性疾病的诊断。理论上，只要样本中有一个病原体存在，PCR 就可以检测到。一般实验室也能检出 10~100 基因拷贝。PCR 对病原体的检测解决了免疫学检测的“窗口期”问题，可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。

  肿瘤

  癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期和良性的阶段就可出现。PCR 技术不但能有效的检测基因的突变，而且能准确检测癌基因的表达量，可据此进行肿瘤早期诊断、分型、分期和预后判断。

  遗传病

  PCR 技术首次临床应用就是从检测镰状细胞和 β-地中海贫血的基因突变开始的。基因的突变和缺失均会引起各种珠蛋白的表达不平衡，用 FQ-PCR 检测各种珠蛋白基因表达差异，是地中海贫血诊断的有效手段。

  其他

  PCR 技术还可以应用于生命科学的方方面面，比如：亲子鉴定，分析远古 DNA 等。

  一点感想：任何一项技术都不是孤立发展的，需要其他技术的配合。PCR 技术也不例外。虽然提出设想很早，但真正变成现实，也是在其他配套技术成熟后才实现的，否则只是空想。

  注：本文由网络资料整理而成。

  后续更新计划，敬请期待吧：

  从零开始学 PCR 技术（一）：PCR 技术简介

  从零开始学 PCR 技术（二）：Taq DNA 聚合酶的应用与改造历程

  从零开始学 PCR 技术（三）：PCR 引物设计

  从零开始学 PCR 技术（四）：常见问题

  从零开始学 PCR 技术（五）：试验污染

  从零开始学 PCR 技术（六）：多重 PCR 的应用

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