RIP（RNA免疫沉淀）实验技术介绍
RIP（RNA免疫沉淀）实验技术介绍
一、技术概述
RIP（RNA Immunoprecipitation）是一种通过特异性抗体富集与目标蛋白结合的RNA分子的技术，广泛应用于研究RNA与蛋白质的相互作用。本技术利用抗体捕获RNA结合蛋白（RBP）及其结合的RNA，结合高通量测序（RIP-Seq）或qPCR分析，可精准解析RNA-蛋白互作网络，揭示其在基因表达调控、疾病发生及细胞功能中的关键作用。
二、实验目的
本技术主要包括RIP-qPCR和RIP-seq两种;其中RIP-qPCR用来验证与目标蛋
白结合的已知RNA，RIP-seq用来筛选与目标蛋白结合的未知 RNA。
三、实验流程
- 细胞裂解
1.HTR-8冻存细胞解冻后1500rpm，离心1min，去上清。
2.每1x107个细胞加入500µl的RIPA裂解液。
3.每ml RIPA裂解液加10µl的PMSF以及磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，
再加入10µl的10%SDS和tritonX-100，翻转裂解过夜，-20℃保存。
- 抗体验证：
- 先配置12%的分离胶，加异丙醇静置20min，待分离胶凝固，吸除异丙醇再用水冲
洗残余的异丙醇，吸水纸吸去残液。加入配置好的5%的浓缩胶，插入梳子，静置20min，待浓缩胶凝固后拔出梳子。
2.安装好电泳装置，上样，先70V,15min，后120V，90min。
3.转膜，湿转120V稳压转100min。
4.封闭，将醋酸纤维膜放入5%的脱脂牛奶中，封闭30min。
5.PBS洗膜3次，每次5min。
6.孵育一抗（1：AGO2,PBS稀释），4℃孵育过夜。
7.PBS洗膜3次，每次10min。
8.孵育二抗（1：1000，PBS稀释），室温孵育2h。
9.PBS洗膜3次，每次10min。
10.按1：1的比例加入试剂盒中的两种发光剂，孵育1min。
11. 把NC膜放到载物台，用化学发光仪进行信号采集。
- 磁珠与抗体结合：
1.标记实验所需的1.5ml EP管，样品包括目的样品，阴性对照与阳性对照。
2.吸取50µl重悬后的磁珠悬液于每个1.5ml EP。
3.每管加入500µl RIP Wash Buffer，涡旋震荡。
4.将1.5ml EP管置于磁力架上，并左右转动15º，使磁珠吸附成一条线，去上清，重复一次
5.用100µl的RIP Wash buffer重悬磁珠，加入约5µg 相应抗体于每个样品中，室
温孵育30min。
6.将1.5ml EP管置于磁力架上，弃上清。
7.加入500µl RIP Wash Buffer，涡旋震荡后弃上清，重复一次。
8.加入RIP Wash Buffer，涡旋震荡后置于冰上。
- 磁珠抗体复合物与蛋白结合：
1.将上一步的EP管放磁力架上，去上清，每管加入900µl 表2所示的RIP Immunoprecipitation Buffer。
表2 RIP Immunoprecipitation Buffer配比
| RIP Wash Buffer |
860µl |
| 0.5M EDTA |
35µl |
| RNase Inhibitor |
5µl |
| Total |
900µl |
- 迅速解冻第一步制备的细胞裂解液，14,000rpm，4℃离心10min。吸取
100µl上清液于上一步的磁珠-抗体复合物中，使得总体积为1ml。4℃孵育3h至过夜
- 孵育完后，短暂离心，将EP管放磁力架上，去上清，加入500µl RIP Wash
Buffer，涡旋震荡后将EP管放磁力架上，去上清，重复5次，总共清洗6次。
（五）RNA洗脱：
- 用150µl表3所示的Proteinase K Buffer重悬上述磁珠-抗体复合物，55℃孵育30min。
表3 Proteinase K Buffer配比
| RIP Wash Buffer |
117µl |
| 10%SDS |
15µl |
| Proteinase K |
18µl |
| Total |
150µl |
- 孵育完后，将EP管放磁力架上，将上清吸入一新的1.5ml EP管中，于每管中加入250µl RIP Wash Buffer。
- RNA纯化：
1. Input样品及sense、antisense、beads 样本分别加入1ml TRIZOL, 颠倒混匀 15 s；
3. 13000 g、4℃离心 10 min，收集上层水相，转移到新无 RNA 酶离心管中；
4. 分别加入 5 µL 糖原（1ug/ul），500 µL 异丙醇充分颠倒混匀；
5. -80℃过夜沉淀 RNA 样品；
6. 13000 g、4℃离心 10 min，弃上清；
7. 分别加入 1 mL 预冷的 75%乙醇，10000 g、4℃离心 5min，弃上清，室温静置风干 10min；
8. 加入15ul DEPC处理水，溶解RNA。
- RNA反转录：
1. 按照下列组分配制RT反应液（反应液制备请在冰上进行）。为了保证反应液配制的准确性，减少分装造成的误差，应按照比实际用量稍大的体积配制反应液，最后加入RNA样品。
| 试剂组分 |
使用量 |
终浓度 |
| 5×PrimeScript Buffer（for Real Time） |
2uL |
1× |
| PrimeScript RT Enzyme Mix I |
0.5uL |
|
| Random 6 mers（100 μM）*1 |
0.5uL |
50 pmol |
| RNA |
7 uL |
2. 按如下程序进行反转录：
37℃,15min；85℃，5sec；-20℃保存备用！
3． 定量PCR检测
1） 将Mix在4℃下融解，轻柔地上下颠倒混匀并进行短暂离心。
2） 冰上配制下表中的反应液
| 成分 |
加入量 |
终浓度 |
| Hieff qPCR SYBR® Green Master Mix (low Rox) |
5μL |
1× |
| Forward Primer (10μM) |
0.2μL |
0.2 μM |
| Reverse Primer (10μM) |
0.2μL |
0.2 μM |
| cDNA（diluted 1:5） |
2μL |
|
| RNase-free Water |
to 10μL |
3）将反应管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。
4）采用三步法程序进行反应：
| 循环数 |
步骤 |
温度 |
时间 |
荧光采集 |
| 1 |
预变性 |
95℃ |
5min |
No |
| 40 |
变性 |
95℃ |
10s |
No |
| 退火 |
60℃ |
30s |
Yes |
|
| 上述反应结束后，从60℃～95℃过程中进行熔解曲线分析 |
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- 技术优势
✅ 高特异性：经验证抗体确保靶标蛋白的高效富集
✅ 兼容性强：支持多种RNA类型（mRNA、lncRNA、miRNA）
✅ 低背景干扰：严格洗涤步骤及对照设计（IgG、Input）确保数据可靠性
- 适用范围
1️⃣ RNA结合蛋白研究
2️⃣ 非编码RNA功能
3️⃣ 疾病机制探索（癌症、神经疾病中异常RNA-蛋白互作的分子基础）
4️⃣ 药物靶点筛选
六、代表性实验结果
