单细胞分析（11）——scRNA-seq数据整合

单细胞 RNA-seq 数据整合：Seurat Integration and Harmony

1. 研究背景

在单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）研究中，批次效应（batch effect） 是不可忽视的问题。不同样本来源（如多个实验室、不同测序平台、不同患者）可能会导致非生物学因素的影响，从而影响数据分析的准确性。

之前单独写过Harmony去除批次，为了更好地整合多个样本，这次使用以下两种方法进行批次校正：

1. SCTransform + Seurat Integration
2. SCTransform + Harmony

Luecken et al. (2022) 研究对 Seurat 方法的评价

在 Luecken et al. (2022)《Benchmarking atlas-level data integration in single-cell genomics》中，Seurat v3 被评估为适合小规模数据整合，尤其适用于细胞类型已知、批次效应较轻的数据。然而，该研究指出，Seurat Integration 在高度异质性数据中可能会过度校正，从而丢失部分生物学变异。因此，对于跨多个实验室的大规模数据，可能需要结合其他方法（如 Harmony）。

SCTransform vs Harmony：核心对比

评估标准	SCTransform + Seurat Integration	SCTransform + Harmony
批次校正能力	强，适用于较小批次间的整合	适中，适用于大规模数据
生物学变异保留	高，适合免疫细胞、癌症数据等	较好，但可能保留部分批次效应
计算时间	较慢（计算锚点消耗资源）	较快（基于 PCA 校正）
适合的应用	细胞互作、DEG 分析	大规模数据整合、UMAP 计算

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2. 数据预处理

数据筛选与清洗

1. 合并不同样本的数据集
2. 剔除低质量细胞（如线粒体基因表达比例过高的细胞）
3. 保留目标样本（如某个特定处理组）

# 读取多个数据集
sample1 <- readRDS('sample1.rds')
sample2 <- readRDS('sample2.rds')
sample3 <- readRDS('sample3.rds')

# 合并样本
data_combined <- merge(sample1, y = c(sample2, sample3), add.cell.ids = c("S1", "S2", "S3"))

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3. SCTransform + Seurat Integration

本方法借鉴于 A comprehensive single-cell breast tumor atlas defines epithelial and immune heterogeneity and interactions predicting anti-PD-1 therapy response 论文，应用于复杂肿瘤微环境的批次整合。

1️⃣ SCT 归一化

# 按来源拆分数据集
sample_list <- SplitObject(data_combined, split.by = "source")

# 设置多线程加速
library(future)
plan("multicore", workers = 4)  # 根据硬件配置调整
options(future.globals.maxSize = 5 * 1024^3)  # 允许更大数据处理（5GB）

# SCTransform 归一化
for (i in 1:length(sample_list)) {
  sample_list[[i]] <- SCTransform(sample_list[[i]], verbose = TRUE, vars.to.regress = c("nCount_RNA", "percent.mt"))
}

2️⃣ 计算整合锚点

features <- SelectIntegrationFeatures(object.list = sample_list, nfeatures = 1500)
sample_list <- PrepSCTIntegration(object.list = sample_list, anchor.features = features)
integration_anchors <- FindIntegrationAnchors(object.list = sample_list, normalization.method = "SCT",
                                              anchor.features = features, dims = 1:30)
data_integrated <- IntegrateData(anchorset = integration_anchors, normalization.method = "SCT")

为什么 FindIntegrationAnchors() 计算非常耗时？

• 计算多个数据集之间的共同特征基因匹配（anchor features）。
• 基于 PCA 计算最近邻（nearest neighbors）以建立整合参考框架。
• 大数据集（10W+ 细胞）可能需要几个小时计算，推荐使用多线程（future）加速。

3️⃣ 选择参考数据集

reference_samples <- c("S1", "S2")
integration_anchors <- FindIntegrationAnchors(object.list = sample_list, reference = reference_samples,
                                              normalization.method = "SCT", anchor.features = features, dims = 1:30)

4️⃣ PCA + UMAP 降维

DefaultAssay(data_integrated) <- "integrated"
data_integrated <- RunPCA(data_integrated, npcs = 50, verbose = FALSE)
data_integrated <- RunUMAP(data_integrated, dims = 1:30, reduction = "pca")

什么时候用 “integrated” ，什么时候用 “SCT”？

使用数据	选择 Assay
批次校正后的 UMAP、聚类分析	integrated
差异表达分析（DEG）、基因通路分析	SCT

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4. SCTransform + Harmony

# SCTransform 归一化
data_combined <- SCTransform(data_combined, verbose = TRUE, vars.to.regress = c("nCount_RNA", "percent.mt"))

# PCA 降维
data_combined <- RunPCA(data_combined)

# Harmony 进行批次校正
data_combined <- RunHarmony(data_combined, group.by.vars = "source", max.iter.harmony = 50, theta = 3)

# 运行 UMAP
data_combined <- RunUMAP(data_combined, reduction = "harmony", dims = 1:30)

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5. 结果对比

方法	批次校正效果	适合下游分析	计算速度
SCTransform + Seurat Integration	优秀，批次效应小，细胞类型分布清晰	适合 DEG、细胞互作分析	较慢
SCTransform + Harmony	一般，批次效应仍然存在	适合 UMAP 聚类分析，但不适合 DEG	更快

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6. 结论与推荐

✅ SCTransform + Seurat Integration 在批次校正方面更优，适用于 DEG 和细胞互作分析。
✅ SCTransform + Harmony 适用于大规模数据，但仍可能存在轻微批次效应，适用于 UMAP 聚类分析。
✅ 如果批次效应较小，建议 Seurat Integration；如果数据规模大且计算资源有限，Harmony 可能是更快的选择。

对于单细胞 RNA-seq 研究，应该在比较去批次效果后，具体进行选择