单细胞数据挖掘(10a)-基于FPKM标准化的单细胞差异分析

本笔记来源于B站@生信技能树-jimmy;学习视频链接: 「生信技能树」单细胞数据挖掘

以下内容是我拷贝自学习资料里的markdown文件,作者信息如文件所示。
本人在学习的过程中做了一些注释、删减和改动。

基于FPKM标准化的单细胞差异分析
李申锁
2020/9/12

前言:使用GSE81861提供的数据,比较CRC肿瘤上皮细胞与正常上皮细胞的差异。GEO提供了count与fpkm两种数据。笔记内容先用官方的fpkm数据做差异分析,再利用counts数据手动计算fpkm矩阵,完成差异分析。最后比较两种方法的结果是否存在差异。

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE81861

注:因为有不少重复的步骤,故设置较多的函数。

image.png

1、概述

1.1 单细胞差异分析pipeline

简单来说分为三步:首先导入、制备规范的表达矩阵以及分组信息;然后利用Seurat包构建seurat对象,归一化;最后进行差异分析,以及结果的可视化。

1.2 count标准化

主要受测序文库(样本总read数)与基因长度的影响,测序的counts数据不能直接进行差异分析,需要进行标准化处理。常见的几种标准化方法简单介绍如下–

  • rpkm:counts先对测序文库标准化,再对基因长度标准化;
  • fpkm:FPKM同RPKM是一样的,只是RPKM用于单末端测序,而FPKM用于双末端测序;
  • tpm:counts先对基因长度标准化,再对测序文库标准化;
  • cpm:counts只对测序文库标准化。

测序文库相对容易计算,直接使用colSums()函数即可;而基因长度则比较难求,首先要了解基因长度有不同的定义标准,其次要知道哪些R包提供相关生物数据。我目前了解到了以下三种方法,以及根据与官方fpkm验证,最终选择第三种方法用于后续的分析。

计算基因长度

(1)TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene包

if (!require("TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene", quietly = TRUE))
  BiocManager::install("TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene")
library(TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene)
txdb <- TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene
exon_txdb=exons(txdb)
genes_txdb=genes(txdb)
g_l.1–根据非冗余外显子之和定义
g_l_1 <- function(){
  o <- findOverlaps(exon_txdb,genes_txdb)
  t1=exon_txdb[queryHits(o)]
  t2=genes_txdb[subjectHits(o)]
  t1=as.data.frame(t1)
  t1$geneid=mcols(t2)[,1]
  # 得到exon_id与geneid的对应关系
  g_l.1 <- lapply(split(t1,t1$geneid),function(x){
    #按gene id拆分表格
    head(x)
    tmp=apply(x,1,function(y){
      y[2]:y[3]
    }) #根据每一个gene所有exon的区间,生成区间内的整数,返回的为list。
    length(unique(unlist(tmp)))
    #计算共有多少种整数,即为最终的非冗余exon长度之和
  })
  head(g_l.1) #为一个list
  g_l.1=data.frame(gene_id=names(g_l.1),length=as.numeric(g_l.1))
  dim(g_l.1)
  head(g_l.1)
  #为基因ID增添ENSEMBLE ID
  if (!require("org.Hs.eg.db", quietly = TRUE))
  BiocManager::install("org.Hs.eg.db")
  library(org.Hs.eg.db)
  s2g=toTable(org.Hs.egENSEMBL)
  head(s2g)
  g_l.1=merge(g_l.1,s2g,by='gene_id') 
  #把g_l,s2g两个数据框以'gene_id'为连接进行拼接
  head(g_l.1)
  return(g_l.1)
}

g_l.1 <- g_l_1()
head(g_l.1)
##   gene_id length      ensembl_id
## 1       1   7255 ENSG00000121410
## 2      10   1317 ENSG00000156006
## 3     100   1532 ENSG00000196839
## 4    1000   4570 ENSG00000170558
## 5   10000   7458 ENSG00000117020
## 6   10000   7458 ENSG00000275199
g_l.2—-根据最长转录本定义
g_l_2 <- function(){
  t_l=transcriptLengths(txdb)
  head(t_l)
  t_l=na.omit(t_l)
  #先按基因ID,再按转录本长度从大到小排序
  t_l=t_l[order(t_l$gene_id,t_l$tx_len,decreasing = T),]
  head(t_l);dim(t_l)
  #根据gene_id去重,选择第一个,也就是最长的那个
  t_l=t_l[!duplicated(t_l$gene_id),]
  head(t_l);dim(t_l)
  g_l.2=t_l[,c(3,5)]
  library(org.Hs.eg.db)
  s2g=toTable(org.Hs.egENSEMBL)
  g_l.2=merge(g_l.2,s2g,by='gene_id') 
  head(g_l.2)
  return(g_l.2)
}
g_l.2 <- g_l_2()
head(g_l.2)
##   gene_id tx_len      ensembl_id
## 1       1   3419 ENSG00000121410
## 2      10   1317 ENSG00000156006
## 3     100   1532 ENSG00000196839
## 4    1000   4367 ENSG00000170558
## 5   10000   7082 ENSG00000275199
## 6   10000   7082 ENSG00000117020

(2)biomaRt包

g_l.3–根据最长转录本定义
g_l_3 <- function(){
  if (!require("biomaRt", quietly = TRUE))
    BiocManager::install("biomaRt")
  library(biomaRt)
  ensembl <- useMart("ensembl") #connect to a specified BioMart database
  ensembl = useDataset("hsapiens_gene_ensembl",mart=ensembl)
  #use the hsapiens(人类) dataset.或者直接如下设置
  #ensembl = useMart("ensembl",dataset="hsapiens_gene_ensembl")
  test <- getBM(attributes=c('ensembl_gene_id', 'start_position',
                             'end_position','ensembl_transcript_id',
                             'transcript_length'),
                mart = ensembl)
  test <- test[order(test$ensembl_gene_id,test$transcript_length,
                     decreasing = T),]
  g_l.3 <- test[!duplicated(test$ensembl_gene_id),]
  g_l.3 <- g_l.3[,c(1,5)]
  head(g_l.3)
  return(g_l.3)
}
g_l.3 <- g_l_3()

比较三种结果的差异

dim(g_l.1);dim(g_l.2);dim(g_l.3)
## [1] 23729     3
## [1] 25159     3
## [1] 67130     2
g_l.1 <- g_l.1[,-1]
colnames(g_l.1) <- c("g_l.1","ensembl_id")
g_l.2 <- g_l.2[,-1]
colnames(g_l.2) <- c("g_l.2","ensembl_id")
colnames(g_l.3) <- c("ensembl_id","g_l.3")
g_l_all <- merge(g_l.1, g_l.2, by="ensembl_id")
g_l_all <- merge(g_l_all, g_l.3, by="ensembl_id")
head(g_l_all,10)
##         ensembl_id g_l.1 g_l.2 g_l.3
## 1  ENSG00000000003  2486  2069  3796
## 2  ENSG00000000005  3031  3031  1205
## 3  ENSG00000000419  1069  1069  1161
## 4  ENSG00000000457  3426  3090  6308
## 5  ENSG00000000460  5654  3852  4355
## 6  ENSG00000000938  3470  2485  2637
## 7  ENSG00000000971  4386  4127  6985
## 8  ENSG00000001036  4415  2749  2385
## 9  ENSG00000001084  6221  3812  3785
## 10 ENSG00000001167  6589  6385  3811
summary(g_l_all) 
##   ensembl_id            g_l.1            g_l.2            g_l.3       
##  Length:23906       Min.   :    20   Min.   :    20   Min.   :    27  
##  Class :character   1st Qu.:  1636   1st Qu.:  1472   1st Qu.:  1660  
##  Mode  :character   Median :  2964   Median :  2515   Median :  2902  
##                     Mean   :  3760   Mean   :  3083   Mean   :  3564  
##                     3rd Qu.:  4934   3rd Qu.:  4104   3rd Qu.:  4743  
##                     Max.   :117846   Max.   :109223   Max.   :109224
#最终选择第三种结果
g_l <- g_l.3

2、官方fpkm数据差异分析

2.1 表达矩阵与分组信息

#表达矩阵
nm_FPKM <- read.csv("GSE81861_CRC_NM_epithelial_cells_FPKM.csv/GSE81861_CRC_NM_epithelial_cells_FPKM.csv")
data_input <- function(data){
  #data <- nm_FPKM
  row.names(data) <- data[,1]
  data <- data[,-1]
  data <- as.matrix(data)
  rownames(data) <- sapply(strsplit(rownames(data),"_"),"[",3)
  rownames(data) <- sapply(strsplit(rownames(data),"[.]"),"[",1)
  colnames(data) <- sapply(strsplit(colnames(data),"_"),"[",1)
  data <- data[grep("ENSG",rownames(data)),]
  return(data)
}

nm_FPKM <- data_input(nm_FPKM)
dim(nm_FPKM)  #56380个基因 #160个样本
## [1] 56380   160
nm_FPKM[1:4,1:4]
##                 RHC4104 RHC6087 RHL2880   RHC5949
## ENSG00000000003   0.000 185.315 323.203 22.311700
## ENSG00000000005   0.000   0.000   0.000  0.000000
## ENSG00000000419   0.000 231.756   0.000  0.851514
## ENSG00000000457 100.135   0.000   0.000  0.000000
tumor_FPKM <- read.csv("GSE81861_CRC_tumor_epithelial_cells_FPKM.csv/GSE81861_CRC_tumor_epithelial_cells_FPKM.csv")
tumor_FPKM <- data_input(tumor_FPKM)
tumor_FPKM[1:4,1:4]
##                 RHC4075 RHC5563 RHC5552 RHC4874
## ENSG00000000003       0   0.000       0       0
## ENSG00000000005       0   0.000       0       0
## ENSG00000000419       0   0.000       0       0
## ENSG00000000457       0 193.167       0       0
dim(tumor_FPKM)#56380个基因 #272个样本
## [1] 56380   272
exp_FPKM <- cbind(nm_FPKM,tumor_FPKM)
dim(exp_FPKM) # 56380个基因   432个样本
## [1] 56380   432
#分组信息
group_dat <- data.frame(group=c(rep('normal',160),
                                rep('tumor',272)),
                        row.names = colnames(exp_FPKM))

2.2 ID转换

因为seurat质控需要过滤线粒体基因,所以需要把ensembl ID转换为 symbol ID

exp_FPKM[1:4,1:4]
##                 RHC4104 RHC6087 RHL2880   RHC5949
## ENSG00000000003   0.000 185.315 323.203 22.311700
## ENSG00000000005   0.000   0.000   0.000  0.000000
## ENSG00000000419   0.000 231.756   0.000  0.851514
## ENSG00000000457 100.135   0.000   0.000  0.000000
id_change <- function(data){
  print(dim(data))
  library(org.Hs.eg.db)
  ids1 <- data.frame(ID=c(1:nrow(data)), 
                     ensembl_id=rownames(data))
  ids2 <- merge(toTable(org.Hs.egENSEMBL),
                toTable(org.Hs.egSYMBOL),by="gene_id")
  ids <- merge(ids1, ids2, by="ensembl_id")
  data <- data[ids$ID,]
  rownames(data) <- ids$symbol
  print(dim(data))
  return(data)
}
exp_FPKM <- id_change(exp_FPKM) #有2w+个ensembl ID没配对到 symbol
## [1] 56380   432
## [1] 24941   432
exp_FPKM[1:4,1:4]
##        RHC4104 RHC6087 RHL2880   RHC5949
## TSPAN6   0.000 185.315 323.203 22.311700
## TNMD     0.000   0.000   0.000  0.000000
## DPM1     0.000 231.756   0.000  0.851514
## SCYL3  100.135   0.000   0.000  0.000000

2.3 创建seurat,质控,差异分析一键操作

scRNA_deg <- function(exp,group){
  library(Seurat)
  print("创建seurat对象...")
  scRNA <- CreateSeuratObject(counts=exp, 
                              meta.data=group)
  print("质控...")
  scRNA[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(scRNA, pattern = "^MT-")
  minGene=500;maxGene=4000;pctMT=15
  scRNA <- subset(scRNA, subset = nFeature_RNA > minGene & nFeature_RNA < maxGene & percent.mt < pctMT)
  print("归一化...")
  scRNA <- NormalizeData(scRNA, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)
  print("差异分析...")
  diff_dat <- FindMarkers(scRNA,ident.1="normal",ident.2="tumor",
                          group.by='group')

}
FPKM_diff <- scRNA_deg(exp=exp_FPKM, group=group_dat)
## [1] "创建seurat对象..."
## [1] "质控..."
## [1] "归一化..."
## [1] "差异分析..."
head(FPKM_diff)
##               p_val avg_logFC pct.1 pct.2    p_val_adj
## GUCA2A 1.353485e-30  2.576937 0.742 0.101 3.375728e-26
## CLCA4  3.106166e-30  1.112995 0.688 0.067 7.747089e-26
## MT1E   7.460402e-28  1.733571 0.789 0.162 1.860699e-23
## CKB    1.723524e-27  2.241367 0.883 0.285 4.298641e-23
## ZG16   1.936670e-27  2.753875 0.664 0.073 4.830248e-23
## PHGR1  5.482718e-27  1.882931 0.938 0.531 1.367445e-22
dim(FPKM_diff)
## [1] 1421    5
FPKM_diff <- FPKM_diff[FPKM_diff$p_val<0.01 & abs(FPKM_diff$avg_logFC)>0.8,]
dim(FPKM_diff)
## [1] 122   5
exp_FPKM_diff <- exp_FPKM[match(rownames(FPKM_diff),rownames(exp_FPKM)),]

2.4 差异结果可视化

热图
my_heatmap <- function(exp_dat){
  n <- t(scale(t(exp_dat)))
  n[n>2]=2;n[n< -2]= -2
  library(pheatmap)
  pheatmap(n, show_rownames = F,
           show_colnames = F,
           annotation_col = group_dat)
}
p.exp_FPKM_diff <- my_heatmap(exp_FPKM_diff)
p.exp_FPKM_diff
image.png
箱图
my_boxplot <- function(data,i){
  library(ggpubr)
  if(!is.numeric(i)){
    i=match(i,rownames(data))
  }
  df <- data.frame(gene=data[i,], group=group_dat$group)
  ggboxplot(df,x="group",y="gene",
            color = "group",add = "jitter",
            ylab = rownames(data)[i]) +
    theme_bw()
}
my_boxplot(exp_FPKM_diff, 2)
image.png
my_boxplot(exp_FPKM_diff, "PGK1")

[图片上传中...(image-3fc0cf-1612477482115-3)]

3、根据count矩阵转换fpkm并完成差异分析

3.1 导入count矩阵

nm_COUNT <- read.csv("GSE81861_CRC_NM_epithelial_cells_COUNT.csv/GSE81861_CRC_NM_epithelial_cells_COUNT.csv")
nm_COUNT <- data_input(nm_COUNT)
nm_COUNT[1:4,1:4]
##                 RHC4104 RHC6087 RHL2880 RHC5949
## ENSG00000000003       0     428      66     141
## ENSG00000000005       0       0       0       0
## ENSG00000000419       0     179       0       1
## ENSG00000000457     465       0       0       0
dim(nm_COUNT)
## [1] 56380   160
tumor_COUNT <- read.csv("GSE81861_CRC_tumor_epithelial_cells_COUNT.csv/GSE81861_CRC_tumor_epithelial_cells_COUNT.csv")
tumor_COUNT <- data_input(tumor_COUNT)
tumor_COUNT[1:4,1:4]
##                 RHC4075 RHC5563 RHC5552 RHC4874
## ENSG00000000003       0       0       0       0
## ENSG00000000005       0       0       0       0
## ENSG00000000419       0       0       0       0
## ENSG00000000457       0     133       0       0
dim(tumor_COUNT)
## [1] 56380   272

3.2 计算fpkm矩阵

my_FPKM <- function(counts,g_l){
  ####根据有基因长度的基因,筛选矩阵子集
  #counts=nm_COUNT
  ng=intersect(rownames(counts),g_l$ensembl_id) 
  length(ng) 
  lengths=g_l[match(ng,g_l$ensembl_id),2]
  names(lengths) <- g_l[match(ng,g_l$ensembl_id),1]
  head(lengths)
  #### 计算样本文库大小,以及最后的fpkm计算
  counts <- counts[names(lengths),]
  counts[1:4,1:4]
  total_count <- colSums(counts)
  head(total_count)
  #根据counts、length、total_count计算fpkm
  FPKM <- t(do.call( rbind,
                     lapply(1:length(total_count),
                            function(i){
                              10^9*counts[,i]/lengths/total_count[i]
                              #lengths向量自动遍历
                            }) ))
  FPKM[1:4,1:4]
  return(FPKM)
}

nm_my_FPKM <- my_FPKM(counts = nm_COUNT,
                      g_l = g_l)
colnames(nm_my_FPKM) <- colnames(nm_COUNT)
nm_my_FPKM[1:4,1:4]
##                  RHC4104  RHC6087  RHL2880    RHC5949
## ENSG00000000003   0.0000 160.5715 168.6839 22.7021034
## ENSG00000000005   0.0000   0.0000   0.0000  0.0000000
## ENSG00000000419   0.0000 219.5694   0.0000  0.5264304
## ENSG00000000457 124.2016   0.0000   0.0000  0.0000000
dim(nm_my_FPKM)
## [1] 50813   160
tumor_my_FPKM <- my_FPKM(counts = tumor_COUNT,
                      g_l = g_l)
dim(tumor_FPKM)
## [1] 56380   272
colnames(tumor_my_FPKM) <- colnames(tumor_COUNT)
nm_my_FPKM[1:4,1:4]
##                  RHC4104  RHC6087  RHL2880    RHC5949
## ENSG00000000003   0.0000 160.5715 168.6839 22.7021034
## ENSG00000000005   0.0000   0.0000   0.0000  0.0000000
## ENSG00000000419   0.0000 219.5694   0.0000  0.5264304
## ENSG00000000457 124.2016   0.0000   0.0000  0.0000000

3.3 差异分析

exp_my_FPKM <- cbind(nm_my_FPKM,tumor_my_FPKM)
dim(exp_my_FPKM) #转换id前
## [1] 50813   432
exp_my_FPKM[1:4,1:4] #转换id前
##                  RHC4104  RHC6087  RHL2880    RHC5949
## ENSG00000000003   0.0000 160.5715 168.6839 22.7021034
## ENSG00000000005   0.0000   0.0000   0.0000  0.0000000
## ENSG00000000419   0.0000 219.5694   0.0000  0.5264304
## ENSG00000000457 124.2016   0.0000   0.0000  0.0000000
exp_my_FPKM <- id_change(exp_my_FPKM) 
## [1] 50813   432
## [1] 24931   432
dim(exp_my_FPKM) #转换id后
## [1] 24931   432
exp_my_FPKM[1:4,1:4] #转换id后
##         RHC4104  RHC6087  RHL2880    RHC5949
## TSPAN6   0.0000 160.5715 168.6839 22.7021034
## TNMD     0.0000   0.0000   0.0000  0.0000000
## DPM1     0.0000 219.5694   0.0000  0.5264304
## SCYL3  124.2016   0.0000   0.0000  0.0000000
my_FPKM_diff <- scRNA_deg(exp=exp_my_FPKM, group=group_dat)
## [1] "创建seurat对象..."
## [1] "质控..."
## [1] "归一化..."
## [1] "差异分析..."
head(my_FPKM_diff)
##               p_val avg_logFC pct.1 pct.2    p_val_adj
## CLCA4  2.640706e-30 1.6080767 0.688 0.067 6.583544e-26
## GUCA2A 3.289287e-30 2.4478445 0.742 0.101 8.200520e-26
## ZG16   1.629645e-27 2.9466466 0.664 0.073 4.062867e-23
## MT1E   2.707239e-27 1.4704522 0.789 0.162 6.749417e-23
## CKB    5.633316e-27 1.9409546 0.883 0.285 1.404442e-22
## PADI2  2.153941e-26 0.5522112 0.734 0.128 5.369989e-22
dim(my_FPKM_diff)
## [1] 1231    5
my_FPKM_diff <- my_FPKM_diff[my_FPKM_diff$p_val<0.01 & abs(my_FPKM_diff$avg_logFC)>0.8,]
dim(my_FPKM_diff)
## [1] 112   5
exp_my_FPKM_diff <- exp_my_FPKM[match(rownames(my_FPKM_diff),rownames(exp_my_FPKM)),]

3.4 可视化

热图
my_heatmap(exp_my_FPKM_diff)
image.png
箱图
my_boxplot(exp_my_FPKM_diff, 2)
image.png
my_boxplot(exp_my_FPKM_diff, "PGK1")
image.png

如上结果,手动计算得到的fpkm结果与官方给出的差异分析结果大致相同,也验证了我们之前的公式。目前,人们认为cpm与tpm相比fpkm的结果更可靠。由于前面二者计算与fpkm相似或更简单,此外限于篇幅,故不做演练。

参考资料:
RPKM, FPKM 与 TPM @医学统计园
基因长度之多少 @生信菜鸟团

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