【现学现卖】实时荧光定量PCR——qPCR

今天说一说qPCR。

1 qPCR简介

之前写过一篇文章笼统地介绍过PCR（【现学现卖】实验-PCR），多数是定性PCR，感兴趣的话可以看看。

这里先捋一下相关PCR的缩写吧。

容易误解的缩写

RT-PCR：Reverse transcription PCR/逆转录PCR。应用很广泛，凡是涉及一条RNA链逆转录为cDNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增都可以叫做RT-PCR，可能应用于定性PCR或者定量PCR。国际上约定俗成的一点是，RT指逆转录。

qPCR/ Real time PCR：Quantitative real-time PCR/实时荧光定量PCR。该PCR过程中每个循环都有数据实时记录，因此可以进行定量分析，有相对定量和绝对定量。

dPCR：Digital PCR/数字PCR。真正的绝对定量PCR，相比于需要借助其他分析的qPCR绝对定量，dPCR可以更加直接地给出DNA的拷贝数。

总之就是RT代表逆转录，q、d代表定量，而real-time就是很real的没有缩写。

关于它的原理，简单地说就是在PCR的基础上，利用其指数扩增特点，加上可以实时检测的荧光物质。

更多实验细节推荐阅读手册：

https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Images/china/PDF/real-pcr-handbook-web.pdf

2 qPCR数据

一、计算

qPCR中最重要的是Ct值。根据目的基因Ct和内参基因Ct的计算可以得到目的基因相对于内参基因的表达趋势。

首先介绍一下log2R数据分析方法，以2为底，对R求对数。

R=（1+E1）^ΔCt1（control-sample）/（1+E2）^ΔCt2（control-sample）

其中：

E1=目的基因引物扩增效率

E2=内参基因引物扩增效率

ΔCt1=实验组目的基因与内参基因Ct值差

ΔCt2=对照组目的基因与内参基因Ct值差

所以可以发现，当扩增效率E为1时，自然推导出常用的ΔΔCt法：

ΔCT = CT(target gene)−CT(reference gene).

ΔΔCT = ΔCT(target sample)−ΔCT(control sample)

即先用内参基因校准，再算样品与对照组间的差异，而我们的表达量的差异就可以表征为

计算和数据处理推荐阅读文献：

DOI https://doi.org/10.1038/nprot.2008.73

二、理想Ct值

对于内参基因，理想情况是各处理组和组内不同样品的测得Ct值稳定、相近；并通过样品浓度的调节，使之在15-25之间。我这里写的范围很大，参考了一些同学的建议，认为不用把范围定的太小，还是应该结合不同的实验，看看合不合适。

比如40个循环，某样品浓度下，内参是25，目的基因都40了，显然建议稀释样品到合适范围。

并且有人的目的基因可能Ct小于内参基因，因为目的基因在这个组织中是更加高度表达的，这个也有可能。

可以在实验最初多查阅资料，设立多个内参基因。

目的基因的Ct值范围更加宽泛（15-35吧），Ct太小（小于10），太大（大于35）的结果都不太可信。

如果通过样品浓度的调节无法改善Ct值，那么有样品污染（一些物质抑制PCR），引物设计（非特异性扩增），扩增效率（MgCl2含量或程序不合适）等很多可能。