ChIP-seq 数据分析

ChIP-Seq仅仅是第一个表观遗传学领域比较成熟的技术而已，目前还有很多其他的技术，比如说

DNA修饰: DNA甲基化免疫共沉淀技术（MeDIP), 目标区域甲基化，全基因组甲基化（WGBS)，氧化-重亚硫酸盐测序（oxBS-Seq), TET辅助重亚硫酸盐测序（TAB-Seq）

RNA修饰: RNA甲基化免疫共沉淀技术（MeRIP)

蛋白质与核酸相互作用： RIP-Seq, ChIP-Seq, CLIP-Seq

还有最近比较火的 ATAC-Seq ATAC-seq 能干啥？(http://www.biotrainee.com/thread-1218-1-1.html)

1 ChIP-Seq技术

1.1 概念

染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）也称结合位点分析法，研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种方法，通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。
将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-seq技术，能高效的在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA片段。

1.2 ChIP-seq技术原理

在生理状态下，把细胞内的DNA与蛋白质交联（Crosslink）后裂解细胞，分离染色体，通过超声或酶处理将染色质随机切割；
利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来；
再通过反交联（Reverse crosslink）释放结合蛋白的DNA片段；
纯化；
测序获得DNA片段的序列，最后将这些DNA片段比对到对应的参考基因组上。

2 ChIP-Seq数据分析

2.1 数据下载

GSE98149 （包含H3K9me3的全部阶段，H3K4me3和H3K27me3的zygote、E6.5 Epi、E6.5 Exe、E7.5 Epi、E7.5 Exe、E8.5 embryo、Esc）
Title：Reprogramming of H3K9me3-dependent heterochromatin during mammalian early embryo development [ChIP-seq]
Organism：Mus musculus

for ((i=594;i<=670;i++));
do
wget ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByStudy/sra/SRP/SRP105/SRP105176/SRR5479$i/SRR5479$i.sra;
done &

# sratookit： .sra 文件 → fastq文件
ls *sra |while read id;
do
/home/chen/sratoolkit.2.8.2-ubuntu64/bin/fastq-dump --gzip --split-3 $id;
done &

# 下载小鼠参考基因组的 index
wget -c "ftp://ftp.ccb.jhu.edu/pub/data/bowtie2_indexes/mm10.zip" &

# 解压
unzip mm10.zip &

2.2 质量控制（data_assess）

# Fastqc 进行质控
ls *fq | while read id; do fastqc -t 4 $id; done &

# multiqc：质控结果批量查看
multiqc *fastqc.zip --export &

## trimmomatic 

# 安装 trimmomatic
wget -c http://www.usadellab.org/cms/uploads/supplementary/Trimmomatic/Trimmomatic-0.38.zip &
unzip Trimmomatic-0.38.zip

# 数据清理
# -threads 设置多线程运行
java -jar "/data/chen/biosoft/Trimmomatic-0.38/trimmomatic-0.38.jar" PE -threads 2 -phred33 \

# 2个输入文件
${name}_1.fq.gz ${name}_2.trim.fq.gz \

# 4个输出文件
${name}_R1.clean.fq.gz ${name}_R1.unpaired.fq.gz \
${name}_R2.clean.fq.gz ${name}_R2.unpaired.fq.gz \

# ILLUMINACLIP:去接头
# "$adapter"/Exome.fa ：adapter 序列的 fasta 文件
# 2：16 个碱基长度的种子序列中可以有 2 个错配
# 30：采用回文模式时匹配得分至少为30 (约50个碱基)
# 10：采用简单模式时匹配得分至少为10 (约17个碱基)
ILLUMINACLIP:"$adapter"/Exome.fa:2:30:10 \

# LEADING:3，从序列的开头开始去掉质量值小于 3 的碱基；
# TRAILING:3，从序列的末尾开始去掉质量值小于 3 的碱基；
# SLIDINGWINDOW:4:15，从 5' 端开始以 4 bp 的窗口计算碱基平均质量，
# 如果此平均值低于 15，则从这个位置截断 read；
# HEADCROP: 在reads的首端切除指定的长度；
# MINLEN:36， 如果 reads 长度小于 36 bp 则扔掉整条 read。
LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 HEADCROP:10 MINLEN:36

2.3 比对到参考基因组（mapping_analysis）

Bowtie2 或 BWA

# bowtie2 [options]* -x  {-1  -2  | -U } -S []

# -p/--threads NTHREADS 设置线程数. Default: 1
# -q reads 是 fastq 格式的
# -x  index 路径
# -1  双末端测序的 _1.fastq 路径。可以为多个文件，并用逗号分开；多个文件必须和 -2  中制定的文件一一对应。
# -2  双末端测序的 _2.fastq 路径.
# -U  非双末端测序的 fastq 路径。可以为多个文件，并用逗号分开。
# -S  输出 Sam 格式文件。
# -3/--trim3  剪掉3'端长度的碱基，再用于比对。(default: 0).
# 用fastqc看了看数据质量，发现3端质量有点问题，我就用了-3 5 --local参数，
# --local 如果fq文件是没有经过 trim 的，可以用局部比对执行 soft-clipping，加上参数--local 。该模式下对read进行局部比对, 从而, read 两端的一些碱基不比对，从而使比对得分满足要求.

bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479594_1.fastq -2 SRR5479594_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/MII_rep1.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479595_1.fastq -2 SRR5479595_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/MII_rep2.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479597_1.fastq -2 SRR5479597_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/sperm_rep1.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479598_1.fastq -2 SRR5479598_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/sperm_rep2.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479596_1.fastq -2 SRR5479596_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/sperm_input.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479599_1.fastq -2 SRR5479599_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/zygote_input.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479605_1.fastq -2 SRR5479605_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/zygote_rep1.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479606_1.fastq -2 SRR5479606_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/zygote_rep2.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479607_1.fastq -2 SRR5479607_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/2cell_rep1.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479608_1.fastq -2 SRR5479608_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/2cell_rep2.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479609_1.fastq -2 SRR5479609_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/4cell_rep1.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479610_1.fastq -2 SRR5479610_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/4cell_rep2.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479611_1.fastq -2 SRR5479611_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/8cell_rep1.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479612_1.fastq -2 SRR5479612_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/8cell_rep2.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479613_1.fastq -2 SRR5479613_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/morula_rep1.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479614_1.fastq -2 SRR5479614_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/morula_rep2.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479615_1.fastq -2 SRR5479615_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/ICM_rep1.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479616_1.fastq -2 SRR5479616_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/ICM_rep2.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479617_1.fastq -2 SRR5479617_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/TE_rep1.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479618_1.fastq -2 SRR5479618_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/TE_rep2.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479623_1.fastq -2 SRR5479623_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/ESC_rep1.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479624_1.fastq -2 SRR5479624_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/ESC_rep2.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479625_1.fastq -2 SRR5479625_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/TSC_rep1.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479626_1.fastq -2 SRR5479626_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/TSC_rep2.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479627_1.fastq -2 SRR5479627_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/TSC_rep3.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479628_1.fastq -2 SRR5479628_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/E65Epi_input.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479634_1.fastq -2 SRR5479634_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/E65Epi_rep1.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479635_1.fastq -2 SRR5479635_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/E65Epi_rep2.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479636_1.fastq -2 SRR5479636_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/E65Exe_input.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479642_1.fastq -2 SRR5479642_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/E65Exe_rep1.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479643_1.fastq -2 SRR5479643_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/E65Exe_rep2.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479644_1.fastq -2 SRR5479644_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/E75Epi_input.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479650_1.fastq -2 SRR5479650_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/E75Epi_rep1.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479651_1.fastq -2 SRR5479651_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/E75Epi_rep2.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479652_1.fastq -2 SRR5479652_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/E75Epi_rep3.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479653_1.fastq -2 SRR5479653_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/E75Epi_rep4.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479654_1.fastq -2 SRR5479654_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/E75Exe_input.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479661_1.fastq -2 SRR5479661_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/E75Exe_rep1.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479662_1.fastq -2 SRR5479662_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/E75Exe_rep2.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479663_1.fastq -2 SRR5479663_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/E85Epi_input.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479669_1.fastq -2 SRR5479669_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/E85Epi_rep1.sam &
bowtie2 -p 6 -q -x /data/chen/Data/reference/index/mm10/mm10 -1 SRR5479670_1.fastq -2 SRR5479670_2.fastq -S /data/chen/Data/GSE98149/chip-seq/h3k9me3/alignment/E85Epi_rep2.sam &

2.4 搜峰（Peak_calling）

MACS2

peaks calling：寻找可能的结合位点，即基因组中大量reads富集的区域。

2.4.1 MACS2 核心: callpeak 用法

   # Example for regular peak calling
    macs2 callpeak -t ChIP.bam -c Control.bam -f BAM -g hs -n test -B -q 0.01
   # Example for broad peak calling
   macs2 callpeak -t ChIP.bam -c Control.bam --broad -g hs --broad-cutoff 0.1

# 批量callpeak
macs2 callpeak -c IgGold.bam -t suz12.bam -q 0.05 -f BAM -g mm -n suz12 2> suz12.macs2.log &
macs2 callpeak -c IgGold.bam -t ring1B.bam -q 0.05 -f BAM -g mm -n ring1B 2> ring1B.macs2.log &
macs2 callpeak -c IgGold.bam -t cbx7.bam -q 0.05 -f BAM -g mm -n cbx7 2> cbx7.macs2.log &
macs2 callpeak -c IgGold.bam -t RYBP.bam -q 0.01 -f BAM -g mm -n RYBP 2>RYBP.macs2.log &

-t/–treatment FILENAME——处理组输入
This is the only REQUIRED parameter for MACS. File can be in any supported format specified by –format option. Check –format for detail. If you have more than one alignment files, you can specify them as -t A B C. MACS will pool up all these files together.

-c/–control——对照组输入
The control or mock data file. Please follow the same direction as for -t/–treatment.

-f/–format FORMAT——-t和-c提供文件的格式，目前MACS能够识别的格式有 “ELAND”, “BED”, “ELANDMULTI”, “ELANDEXPORT”, “ELANDMULTIPET” (双端测序), “SAM”, “BAM”, “BOWTIE”, “BAMPE”, “BEDPE”. 除”BAMPE”, “BEDPE”需要特别声明外，其他格式都可以用 AUTO自动检测。如果不提供这项，就是自动检测选择。
Format of tag file, can be “ELAND”, “BED”, “ELANDMULTI”, “ELANDEXPORT”, “ELANDMULTIPET” (for pair-end tags), “SAM”, “BAM”, “BOWTIE”, “BAMPE” or “BEDPE”. Default is “AUTO” which will allow MACS to decide the format automatically. “AUTO” is also usefule when you combine different formats of files. Note that MACS can’t detect “BAMPE” or “BEDPE” format with “AUTO”, and you have to implicitly specify the format for “BAMPE” and “BEDPE”.

-g/–gsize——基因组大小，默认提供了hs, mm, ce, dm选项，不在其中的话，比如说拟南芥，就需要自己提供了（拟南芥根据NCBI显示是119,667,750，也就是1.2e8）。
PLEASE assign this parameter to fit your needs!
It’s the mappable genome size or effective genome size which is defined as the genome size which can be sequenced. Because of the repetitive features on the chromsomes, the actual mappable genome size will be smaller than the original size, about 90% or 70% of the genome size. The default hs – 2.7e9 is recommended for UCSC human hg18 assembly. Here are all precompiled parameters for effective genome size:
hs: 2.7e9 （人类是2.7e9，也就是2.7G）
mm: 1.87e9
ce: 9e7
dm: 1.2e8

-n/–name——输出文件的前缀名。表示实验的名字, 请取一个有意义的名字。
The name string of the experiment. MACS will use this string NAME to create output files like ‘NAME_peaks.xls’, ‘NAME_negative_peaks.xls’, ‘NAME_peaks.bed’ , ‘NAME_summits.bed’, ‘NAME_model.r’ and so on. So please avoid any confliction between these filenames and your existing files.

-B/–bdg
会保存更多的信息在bedGraph文件中，如fragment pileup, control lambda, -log10pvalue and -log10qvalue scores。
If this flag is on, MACS will store the fragment pileup, control lambda, -log10pvalue and -log10qvalue scores in bedGraph files. The bedGraph files will be stored in current directory named NAME+’_treat_pileup.bdg’ for treatment data, NAME+’_control_lambda.bdg’ for local lambda values from control, NAME+’_treat_pvalue.bdg’ for Poisson pvalue scores (in -log10(pvalue) form), and NAME+’_treat_qvalue.bdg’ for q-value scores from Benjamini–Hochberg–Yekutieli procedure http://en.wikipedia.org/wiki/False_discovery_rate#Dependent_tests

-q/–qvalue——q值，也就是最小的PDR阈值， 默认是0.05。q值是根据p值利用BH计算，也就是多重试验矫正后的结果。
The qvalue (minimum FDR) cutoff to call significant regions. Default is 0.01. For broad marks, you can try 0.05 as cutoff. Q-values are calculated from p-values using Benjamini-Hochberg procedure.

-p/–pvalue——p值，指定 p 值后 MACS2 就不会用 q 值了。
The pvalue cutoff. If -p is specified, MACS2 will use pvalue instead of qvalue.

-m/–mfold——和MFOLD有关，而MFOLD和MACS预构建模型有关，默认是5：50，MACS会先寻找100多个peak区构建模型，一般不用改，因为你不懂。
This parameter is used to select the regions within MFOLD range of high-confidence enrichment ratio against background to build model. The regions must be lower than upper limit, and higher than the lower limit of fold enrichment. DEFAULT:5,50 means using all regions not too low (>5) and not too high (<50) to build paired-peaks model. If MACS can not find more than 100 regions to build model, it will use the –extsize parameter to continue the peak detection ONLY if –fix-bimodal is set.

2.4.2 callpeak 结果文件说明

# （在当前目录下）统计 *bed 的行数（peak数）
wc -l *bed
  2384 cbx7_summits.bed
  8342 ring1B_summits.bed
     0 RYBP_summits.bed
  7619 suz12_summits.bed
# 在文件a中统计 hello 出现的行数:
# grep hello a | wc -l
# wc（word count）
#-c 统计字节数。
#-l 统计行数。line
#-m 统计字符数。这个标志不能与 -c 标志一起使用。
#-w 统计字数。一个字被定义为由空白、跳格或换行字符分隔的字符串。
#-L 打印最长行的长度。

callpeak会得到如下结果文件：

NAME_summits.bed：Browser Extensible Data，记录每个peak的peak summits，话句话说就是记录极值点的位置。MACS建议用该文件寻找结合位点的motif。能够直接载入UCSC browser，用其他软件分析时需要去掉第一行。

NAME_peaks.xls：以表格形式存放peak信息，虽然后缀是xls，但其实能用文本编辑器打开，和bed格式类似，但是以1为基，而bed文件是以0为基.也就是说xls的坐标都要减一才是bed文件的坐标。

NAME_peaks.narrowPeak，NAME_peaks.broadPeak 类似。后面4列表示为， integer score for display， fold-change，-log10pvalue，-log10qvalue，relative summit position to peak start。内容和NAME_peaks.xls基本一致，适合用于导入R进行分析。

NAME_model.r：能通过$ Rscript NAME_model.r作图，得到是基于你提供数据的peak模型。

.bdg：能够用 UCSC genome browser 转换成更小的 bigWig 文件。

2.4.3 bdg file → wig file

为了方便在IGV上查看ChIP-seq的结果和后期的可视化展示，需要把macs2的结果转化为bw提供给IGV。一共分为三步：

第一步：使用 bdgcmp 得到 FE 或者 logLR 转化后的文件 (Run MACS2 bdgcmp to generate fold-enrichment and logLR track)

macs2 bdgcmp -t H3K36me1_EE_rep1_treat_pileup.bdg -c H3K36me1_EE_rep1_control_lambda.bdg -o H3K36me1_EE_rep1_FE.bdg -m FE

macs2 bdgcmp -t  H3K36me1_EE_rep1_treat_pileup.bdg -c H3K36me1_EE_rep1_control_lambda.bdg -o H3K36me1_EE_rep1_logLR.bdg  -m logLR -p 0.00001

# 参数解释
# -m FE 计算富集倍数降低噪音
# -p 为了避免log的时候input值为0时发生error，给予一个很小的值

第二步：预处理文件，下载对应参考基因组染色体长度文件

使用conda安装以下三个处理软件：
bedGraphToBigWig
bedClip
bedtools

下载染色体长度文件：http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/chromInfo.txt.gz 并解压（针对human，其余物种的皆可以按照类似网址下载）

写一个小小的sh脚本方便一步转化name.sh：

#!/bin/bash
# check commands: slopBed, bedGraphToBigWig and bedClip
which bedtools &>/dev/null || { echo "bedtools not found! Download bedTools: "; exit 1; }
which bedGraphToBigWig &>/dev/null || { echo "bedGraphToBigWig not found! Download: "; exit 1; }
which bedClip &>/dev/null || { echo "bedClip not found! Download: "; exit 1; }
# end of checking
if [ $# -lt 2 ];then
echo "Need 2 parameters!  "
exit
fi
F=$1
G=$2
bedtools slop -i ${F} -g ${G} -b 0 | bedClip stdin ${G} ${F}.clip
LC_COLLATE=C sort -k1,1 -k2,2n ${F}.clip > ${F}.sort.clip
bedGraphToBigWig ${F}.sort.clip ${G} ${F/bdg/bw}
rm -f ${F}.clip ${F}.sort.clip

chmod +x name.sh

第三步：生成 bw 文件

./name.sh H3K36me1_EE_rep1_FE.bdg hg19.len
./name.sh H3K36me1_EE_rep1_logLR.bdg hg19.len

最后得到产物，至于的使用哪一个作为输入文件大家就根据需要来吧

H3K36me1EErep1_FE.bw
H3K36me1EErep1_logLR.bw

2.5 峰注释（Peak_anno）

ChIPseeker

ChIPseeker的功能分为三类：
注释：提取peak附近最近的基因，注释peak所在区域。
比较：估计ChIP peak数据集中重叠部分的显著性；整合GEO数据集，以便于将当前结果和已知结果比较。
可视化：peak的覆盖情况；TSS区域结合的peak的平均表达谱和热图；基因组注释；TSS距离；peak和基因的重叠。

# 加载ChIPseeker、基因组注释包和bed数据
biocLite("ChIPseeker")
biocLite("org.Mm.eg.db")
biocLite("TxDb.Mmusculus.UCSC.mm10.knownGene")
library("ChIPseeker")

# 下载
source ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
biocLite("ChIPseeker")
biocLite("org.Mm.eg.db")
biocLite("TxDb.Mmusculus.UCSC.mm10.knownGene")
biocLite("clusterProfiler")
biocLite("ReactomePA")
biocLite("DOSE")

#载入
library("ChIPseeker")
library("org.Mm.eg.db")
library("TxDb.Mmusculus.UCSC.mm10.knownGene")
txdb <- TxDb.Mmusculus.UCSC.mm10.knownGene
library("clusterProfiler")

# 读入bed文件
ring1B <- readPeakFile("F:/Data/ChIP/ring1B_peaks.narrowPeak")
cbx7 <- readPeakFile("F:/Data/ChIP/cbx7_peaks.narrowPeak")
RYBP <- readPeakFile("F:/Data/ChIP/RYBP2_summits.bed")
suz12 <- readPeakFile("f:/Data/ChIP/suz12_peaks.narrowPeak")

Chip peaks coverage plot

查看peak在全基因组的位置

covplot(ring1B,chrs=c(“chr17”, “chr18”)) #specific chr

ring1B

suz12

cbx7

RYBP

ring1B(chr17&18)

● Heatmap of ChIP binding to TSS regions

promoter <- getPromoters(TxDb=txdb, upstream=3000, downstream=3000)
tagMatrix <- getTagMatrix(ring1B, windows=promoter)
tagHeatmap(tagMatrix, xlim=c(-3000, 3000), color=”red”)

Average Profile of ChIP peaks binding to TSS region

● Confidence interval estimated by bootstrap method

plotAvgProf(tagMatrix, xlim=c(-3000, 3000), conf = 0.95, resample = 1000)

peak的注释

peak的注释用annotatePeak**，TSS (transcription start site) region 可以自己设定，默认是（-3000，3000），TxDb 是指某个物种的基因组，例如TxDb.Hsapiens.UCSC.hg38.knownGene, TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene for human genome hg38 and hg19, TxDb.Mmusculus.UCSC.mm10.knownGene and TxDb.Mmusculus.UCSC.mm9.knownGene for mouse mm10 and mm9.

peakAnno <- annotatePeak(ring1B, tssRegion=c(-3000, 3000),
TxDb=txdb, annoDb=”org.Mm.eg.db”)

可视化 Pie and Bar plot

plotAnnoBar(peakAnno)
vennpie(peakAnno)
upsetplot(peakAnno)

饼图:

条形图：

upsetplot: upset技术适用于多于5个集合的表示情况。

可视化TSS区域的TF binding loci

plotDistToTSS(peakAnno,
title=”Distribution of transcription factor-binding loci\nrelative to TSS”)

多个peak的比较

多个peak set注释时，先构建list,然后用lapply. list(name1=bed_file1,name2=bed_file2)RYBP的数据有问题，这里加上去，会一直报错。

peaks <- list(cbx7=cbx7,ring1B=ring1B,suz12=suz12)
promoter <- getPromoters(TxDb=txdb, upstream=3000, downstream=3000)
tagMatrixList <- lapply(peaks, getTagMatrix, windows=promoter)
plotAvgProf(tagMatrixList, xlim=c(-3000, 3000))
plotAvgProf(tagMatrixList, xlim=c(-3000, 3000), conf=0.95,resample=500, facet=”row”)
tagHeatmap(tagMatrixList, xlim=c(-3000, 3000), color=NULL)

ChIP peak annotation comparision

peakAnnoList <- lapply(peaks, annotatePeak, TxDb=txdb,
tssRegion=c(-3000, 3000), verbose=FALSE)
plotAnnoBar(peakAnnoList)
plotDistToTSS(peakAnnoList)

Overlap of peaks and annotated genes

genes= lapply(peakAnnoList, function(i) as.data.frame(i)$geneId)
vennplot(genes)