pcr技术发展史——人类核酸研究的前世今生
人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。在此，pcr技术应运而生。
PCR(Polymerase Chain Reaction)，即“聚合酶链式反应”，是为了解决在体外特异性地扩增某个基因的问题，从而满足对核酸的体外研究和应用。
pcr技术发展：
| 时间 | 大事记 |
| 1953 DNA结构基础 |
沃森和克里克发表的DNA双螺旋结构模型标志着分子生物学的诞生，这一成果也被誉为20世纪以来生物学方面最伟大的发现[1]。自此，人类一直在探索研究DNA的新方法，新技术。 |
| 1971 PCR技术雏形 |
Khorana第一个成功完成基因的合成—丙氨酸tRNA编码基因[2]；Kleppe提出体外扩增设想[3]。但由于当时的技术水平有限，并且具有较强稳定性的DNA聚合酶还未被发现，DNA体外扩增技术并未获得全面推广。 |
| 1985 PCR技术首次提出 |
Mullis阐述了具有划时代意义的PCR技术[4]。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中提供体外合成合适的条件---模版DNA，寡核苷酸引物，dNTP，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。最初使用的大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段不耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。耗时、费力、易出错。 |
| 1988 PCR技术的优化 |
Saiki等在黄石公园温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus, Taq) 中提取到一种耐高温DNA聚合酶[5]。该酶耐高温的性质使其热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶,从而极大地提高了PCR扩增的效率。Taq酶的发现，使得PCR真正变为现实，为其自动化铺平了道路。 |
| 1989 PCR爆炸年 |
美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首，将热稳定DNA聚合酶命名为“年度分子”。 |
| 1996年 qpcr登上舞台 |
1996年，Real Time Quantitative PCR的发表标志着qPCR的诞生[4]。它引入了荧光标记的水解探针，并在每个PCR循环的延伸结束后采集荧光信号，将到达指数扩增期所需的循环数（Ct值，后经标准化统一为Cq值）与模板的初始浓度建立了关系 |
| 20世纪末 数字pcr出现 |
至20世纪末，Vogelstein 等提出数字PCR( digitalPCR，dPCR) 的概念，将一个样本分充分稀释，分配到不同的反应单元，每个单元包含少于或等于一个拷贝的目标分子( DNA 模板) ，在每个反应单元中进行单独、平行的PCR反应分，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析，以实现绝对定量及稀有等位基因的检测。 |
随着生物实验需求的不断发展，PCR技术在其发展的历程中，已经逐渐演化出一系列侧重于不同实验目的及应用的PCR分类，其中较为常见的包括：touchdown PCR、multiplex PCR、qPCR以ddPCR。
pcr试剂发展：
PCR试剂根据用途可分为：
1.提取试剂，包括了各种提取dna的常用试剂，和纯化所用的试剂
2.pcr扩增试剂：主要是taq酶，dntp（四种碱基），缓冲试剂（buffer），引物
3.产物检测试剂：琼脂糖，聚丙烯酰胺凝胶，aps，tmed，eb等等
而其中DNA聚合酶是pcr中比较重要的试剂：
在PCR技术中，DNA聚合酶起着至关重要的作用，从某种意义上说，DNA聚合酶的研究进展决定着PCR技术的发展趋势和应用范围，研究者们一直在努力探寻着酶学性能好、保真度高的PCR用DNA聚合酶。
| 时间 | 大事记 |
| 1985 PCR技术首次提出 |
Mullis阐述了具有划时代意义的PCR技术[4]。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中提供体外合成合适的条件---模版DNA，寡核苷酸引物，dNTP，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。最初使用的大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段不耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。耗时、费力、易出错。 |
| 1985 Klenow酶 |
1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等科学家发明了具有划时代意义的聚合酶链 式反应，但其最早使用的DNA聚合酶是⑶// DNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生 成的C末端605个氨基酸残基片段,即Klenow酶。该片段保留了 DNA聚合酶I的5'—3'聚合酶和3'—5' 外切酶活性，但缺少完整酶的5'—3'外切酶活性。Klenow酶不耐高温，在60尤下就会很快变性失活，引物链延伸反应需在37T下进行，因此每次循环都要重新添加Klemovv酶 |
| 1988年 Taq DNA聚合酶 |
Saiki等在黄石公园温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus, Taq) 中提取到一种耐高温DNA聚合酶[5]。该酶耐高温的性质使其热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶,从而极大地提高了PCR扩增的效率。Taq酶的发现，使得PCR真正变为现实，为其自动化铺平了道路。 |
| Tth DNA 聚合酶 | Tth DNA 聚合酶是是从嗜热性嗜热杆菌 HB8 中分离的一种分子量为 94 KD 的单亚基聚合酶，与 Taq酶相比在氨基酸序列上具有 88%的同源性，其基本特性与 Taq 酶相似，具有 5'→3' 聚合酶活性和 5'→3' 外切酶活性，不具 3'→5' 外切酶活性。最适温度在75℃，在 95℃时酶活性半衰期为 20 min。在高温条件下，当反应体系中存在 Mn2+，该酶具有很强的反转录酶活性，能有效地将 RNA 反转录成 c DNA。当鳌合了 Mn2+后再加入 Mg2+，则可以使该酶的聚合酶活性增 加，反转录产生的 c DNA 在此酶的作用下还可以进行 PCR 扩增，使得 c DNA 的合成与扩增用同一种酶。由于普通的逆转录酶如 M-MLV、ANV 等的最适反应温度为 37℃，在此温度条件下反应，RNA 分子形成的发夹、回环等高级结构很难克服，致使反转录合成过程效率大为下降，而 Tth DNA 聚合酶在较高的温度下进行逆转录，增加了引物杂交和延伸的特异性，减少了由于 RNA 二级结构引起的问题，所以现在被广泛用于反转录－聚合酶链式反应 （RT-PCR），对于从RNA 水平检测和分析基因表达十分有用。 |
| Vent DNA 聚合酶酶 |
Vent DNA 聚合酶是美国 New England Biolabs 公司由海底火山口生长的嗜热高温球菌中分离纯化 获得的，相对分子量为 85 KD。该酶具有强的 5'→ 3'DNA 聚合酶活性，兼有 3'→5' 外切酶活性，没有检 测到 5'→3' 外切酶活性。Vent DNA 聚合酶是被分离 得到的第一个具有 3′→5′核酸外切酶活性的热稳定 DNA 聚合酶。3'→5' 外切酶活性的主要功能是校对作 用，当加入的核苷酸与模板不互补而游离时则被 3'→ 5' 外切酶切除，以便重新在这个位置上聚合对应的核 苷酸，从而有效降低碱基错误掺入率，提高扩增结果 的忠实性。因此，Vent DNA 聚合酶是一种高保真的 耐热 DNA 聚合酶，其保真度比 Taq DNA 聚合酶高 5~15 倍。Vent DNA 聚合酶热稳定性极好，97.5℃下半衰期长达 130 min，且该酶扩增长片断（>12 Kb）的功能较强。 |
| Pfu DNA 聚合酶 |
Pfu DNA 聚合酶来自激烈热球菌。该酶分子量约为 90 KD，具有 5'→3'DNA 聚合酶和 3'→5' 外切酶活
随着分子生物学研究的不断发展和深入，PCR 技 |
Taq DNA聚合酶发现了几十年，不但没有被取代，反而在分子生物学领域具有越来越广泛的应用。这一方面依赖于它自身的功能和特点，另一方面也依赖于研究人员对其不断的进化与改造。通过定点突变、结构域重组、定向进化等技术，Taq DNA聚合酶获得了许多催化性能改善或展现新功能的突变体，拓宽了酶的应用范围，下面就来做一个回顾。
-
通过理性设计得到的突变体
①缺失突变体。Taq DNA聚合酶的第一个突变体就是N端删除大片段了，根据删除长度的差异，有不同的名称：KlenTaq(∆236)（Barnes, 1992），Klentaq1(∆280)（U.S. Patent 5436149），Stoffel(∆289)（Lawyer, 1993），它们本质上是一样的，都是5’-3’外切结构域缺失的突变体。N端删除Taq的耐热型、盐离子耐受能力、保真性都有所提高，但持续合成能力显著下降，对引物3’端错配的敏感性明显降低，这说明5’-3’外切结构域对酶的整体构象可能有很大的影响。研究人员发现大肠杆菌pol I后，又发现一种N端截短的Klenow片段，后者在DNA扩增上具有更好的表现，因此，研究人员得到Taq DNA聚合酶后，发现它与pol I有很多相似之处，自然而然的会进行这种尝试。根据结构或功能相似的酶对目标酶进行结构域编辑或者氨基酸替换，是一种常用的分子改造策略。
②Sanger测序突变体。使用Taq作为测序酶时发现，Taq无法掺入顺利ddNTP（除ddGTP），Tabor等（Tabor, 1995）通过F667Y突变体解决了这个问题。但是Taq(F667Y)掺入ddNTPs的速率不均匀，强烈偏向ddGTP，Li等（1999）在Klentaq1与ddNTP复合物晶体结构的基础上，对R660残基进行突变，结果R660D/F667Y双突变体掺入ddGTP与其它双脱氧核糖核苷酸的速率基本一致。根据酶-底物复合物的晶体结构对酶进行理性设计是一种常用的酶进化方式，当然也比较有难度，很多时候酶-底物的晶体甚至酶的晶体不易得，即使得到晶体结构，也很难判断关键的氨基酸。通常的做法是根据酶-底物的分子相互作用，扫描活性口袋的氨基酸，这种方法经常能在增强底物亲和力、拓宽底物谱方面得到满意的结果。 -
通过定向进化得到的突变体
定向进化是一种十分强大的酶分子改造技术，与理性设计的“所见即所得”不同，它的的特点是“所筛即所得”。定向进化允许构建庞大的突变体库，这就让酶有了各种可能（在自然界中这可能需要几百万年以上的时间），只要找到高效的筛选方法，一般都能得到令人惊喜的结果。构建突变体的方法有易错PCR、DNA改组、交错延伸PCR、体外随机延伸PCR等，筛选一般包括初筛与复筛，初筛依靠添加筛选压力让目标突变体留存下来，复筛将留存下来的克隆进行性能比较，从而选出最优秀的突变体。筛选的主要压力来自于初筛，必须具有高通量的方法，因为突变体库多样性可达108-109，一般采用与显色化学反应，酶促反应偶联产生便于观察的信号。
2001年，Ghadessy等报道了一种分区自我复制（Compartmentalized Self-replication，CSR）技术，该技术通过油水混合，形成一个个微小的油包水体系，每个体系就好像一个独立的隔离室，含有携带Taq DNA聚合酶突变体的大肠杆菌、dNTP、PCR buffer和Taq DNA聚合酶的引物，油包水体系在高温条件下仍具有很高的稳定性，通过预热变性，大肠杆菌释放出Taq DNA聚合酶，通过PCR循环，在筛选压力条件下，具有高活性的突变体以自身基因为模板进行PCR扩增，无义突变体被淘汰，反应结束纯化被富集的DNA产物，即得到了优秀的突变体基因。
（Ghadessy F J, 2001）CSR总体方案。 （1）在大肠杆菌中克隆并表达聚合酶基因，球形代表有活性的聚合酶分子。 （2）将含有聚合酶和编码基因的细菌细胞悬浮在含有引物和dNTP的反应缓冲液中，并分离到水室中。 （3）聚合酶从细胞中释放出来，进行自我复制。 活性低的聚合酶（白色六边形）无法复制其编码基因。释放后代聚合酶基因并重新克隆，以进行另一轮CSR。
Ghadessy等得到两个突变体：T8（F73S, R205K, K219E, M236T, E434D, A608V），在97.5°C下的半衰期提高11倍，但催化效率和保真性有所下降；H15（K225E, E388V, K540R, D578G, N583S, M747R），对高浓度肝素抑制剂抗性提高130倍以上，但耐热性显著下降，催化活性也有下降。虽然本次研究没有得到非常优秀的突变体，但CSR技术为热稳定DNA聚合酶的定向进化提供了高效筛选方法，这种方法远比结果更有意义。
③热启动突变体。Kermekchiev等（Kermekchiev, 2003）以Klentaq为模板，通过易错PCR得到突变体库，然后利用一种基于放射性dNTP标记的在位筛选方法得到一个Klentaq Cs3AC（E626K，I707L）突变体，该突变体在37℃时活性明显降低，但68℃时仍保持正常活性，是一款极具潜力的热启动酶。2009年，该团队在Cs3AC的基础上对706-708残基进行饱和扫描突变，经过筛选得到一个突变体Klentaq 10（E626K， I707L，E708K），该突变体的全血抑制抗性、土壤抑制抗性、荧光染料抑制抗性比野生酶都有提高，研究人员将三个氨基酸替换平移到全长Taq DNA聚合酶上之后，得到一突变体Taq 22（E626K， I707L，E708Q）抑制剂抗性比野生Taq显著提高。Taq 22不但获取了冷敏感特征，提高了抑制剂抗性，还保持了野生Taq的热稳定性和催化活性，如果配合TP7抗体，具有“热启动”PCR试剂盒开发的潜力。
④逆转录活性突变体。野生型Taq DNA聚合酶没有逆转录活性，但Sauter等（Sauter, 2006）以KlenTaq为模板通过易错PCR和微孔板筛选，得到两个个逆转录活性提高的突变体：KlenTaq M1（L322M，L459M，S515R，I638F，S739G，E773G），KlenTaq M2（L322M，L459M，S515R，I638F，S739G，E773G，L789F）。为了将这种增强的逆转录活性用于基于探针的一步法RT-qPCR检测，Kranaster等（Kranaster, 2010）将KlenTaq M1的突变平移到全长Taq上，得到一个新突变体Taq M1，结果Taq M1即基本保留了野生Taq酶的PCR性能，又显著增强了逆转录活性。Blatter等（Blatter, 2013）进一步将M1的突变与M747K（Gloeckner, 2007）混组，得到一个新突变体RT-KTq2（L459M，S515R，I638F，M747K），RT-KTq2的逆转录能力比KlenTaq M1更强，并且DNA模板扩增能力也有所提高。RT-KTq2的高耐热性有利于提高RT-PCR的特异性，RT-KTq2无RNase H活性，降低了RNA损伤，因为兼具DNA聚合酶活性，可以实现了逆转-扩增一酶化。Blatter等用RT-KTq2对几个人源基因进行的基于SYBR的RT-qPCR检测，得到了不错的扩增曲线，但作者没有与商品化MMLV/Taq逆转录试剂盒对比，如果RT-KTq2能达到或接近MMLV的逆转录活性，那么RT-KTq2能够成为一款优秀的逆转录扩增酶。
⑤抑制剂抗性突变体。从各种各样的样本中进行核酸检测，是PCR的一个重要应用领域。一般的流程是，先从样本中将核酸提取出来，再用DNA聚合酶进行PCR扩增，最后根据核酸电泳条带或者荧光信号等方式观察扩增结果。有时候，因为样本的稀有性等原因无法提取DNA，或者基于检测时效性和便利性的考虑，我们希望能够直接从样本中扩增靶标基因，比如血液、动植物组织、土壤。这些样本中的复杂组分可能对DNA聚合酶有很强的抑制作用，失败的扩增会造成假阴性的误判，这促使研究人员通过分子改造提高聚合酶的抑制剂耐受性。野生型Taq DNA聚合酶对血液、土壤等抑制剂的耐受性很差，N端删除大片段的耐受性有所提高，但仍然难以满足要求。Kermekchiev等（Kermekchiev, 2009）通过定点饱和扫描突变得到的Klentaq 10和Taq 22突变体，可以耐受25%的全血和15%的土壤提取物，E708残基可能发挥了重要作用。相比一般的定向进化手段，CSR技术为获得高抑制剂耐受性突变体提供了基础。Baar等（Baar, 2011）选择了与Taq DNa聚合酶序列同源性较高的八个物种的聚合酶为亲本，通过StEP技术获得8T嵌合体文库，以泥炭提取物、焦油、腐植酸等抑制剂为筛选压力，经过三轮CSR，得到了一个优秀突变体2D9。2D9是由四种不同的聚合酶混组的嵌合体，在多种抑制剂存在条件下，耐受性都有显著的提高，并且保真度与野生Taq基本一致。 -
-
（Baar C, 2011）不同抑制剂下2D9对野生型Taq的相对活力
-
- 2014年，该团队（Arezi, 2014; Hogrefe, 2016）通过CSR得到一个新的全长Taq突变体Taq 2C2（G59W，V155I，L245M，L375V，E507K，E734G，F749I），对EDTA血耐受比例达到65%，对肝素血耐受达到25%，催化速率也比野生酶有所提高，可以作为直接血液核酸检测试剂盒的聚合酶。2016年，Schafer等以Taq-E507K为亲本，通过定向进化得到一个突变体Taq 15（A61T, K346E, S357C, E507K, I707M, F749I），该突变体对PCR buffer中的缓冲液、盐离子浓度具有极高的耐受性，可以很好的直接从葡萄、马铃薯叶片中扩增>1Kb的DNA片段，可用于植物叶片直扩PCR试剂盒的研发。
⑥快速延伸突变体。Taq DNA聚合酶在72℃时延伸速率大约是60nt/s，但实际中一般以1kb/min的速率扩增，一般一个PCR扩增下来，需要1-2h的时间。对于大样本量的检测或者时间要求急迫的检测，人们希望能够更快的扩增。Taq 2C2突变体的催化效率大约是野生Taq的2倍，氨基酸突变E507K对这种增强作用有重要意义。在一些报道中，直接提高Taq DNA聚合酶Kcat的突变体不多，但一般增加了模板亲和力或容错能力的突变体，往往在较短时间内扩增长片段的能力也同样增强。
⑦长片段扩增突变体。Taq DNA聚合酶在长片段扩增上，最卓越的成果是Klentaq1与Pfu混合酶（Barnes, 1994; U.S. Patent 5436149），可以扩增长达35kb的Lambda DNA片段，保真性也比Taq DNA聚合酶显著提高，但单独的Klentaq1持续合成能力是显著下降的（比Taq低10倍）。Ignatov等（US 11/658,610）将Tth DNA polymerase（该酶的扩增能力高于Taq，但区分对引物3’错配不敏感）的N端4-600多肽与Taq DNA polymerase的C端554-832多肽拼接成一个新的嵌合体酶Tth-Taq，嵌合体的扩增能力接近Tth，延伸能力比Taq酶显著提高。将具有DNA结合能力的ssDNA或dsDNA结合蛋白与Taq DNA聚合酶融合，也能提高酶的延伸能力，但真正意义上的长延伸突变体，还是Yamagami等（Yamagami, 2014）通过对E742和A743的扫描突变得到的。E742A和A743H两个突变体能够很好的从Lambda DNA上扩增15kb的长片段（条件：99℃ 5 s，66℃ 5 min，30个循环）。然而有趣的是，E742A/A743H双突变体的引物延伸能力比单突变强得多，但PCR效果却不如单突变体。凝胶迁移实验的结果表明双突变体与DNA产物有更强的结合能力（在电泳图上产生拖带），这可能不利于PCR起始阶段的扩增，导致PCR失败。我在融合Sso7d结构域与KOD DNA聚合酶时，也发现了类似的情况。有研究人员认为，Taq DNA聚合酶校正活性的缺失限制了其长片段扩增能力，因为随着目标产物长度的增加，延伸过程出错配的概率也就越高，阻挡了继续延伸，保真酶因为能切除错配，往往具有更强的持续延伸能力。这个解释符合事实，我认为长片段延伸突变体除了提高Taq DNA聚合酶的DNA亲和力，也可能增加了“容错”能力，实际上是降低了保真性，这类突变体的实际应用意义不太大，高保真聚合酶在这方面明显具更有优势。
⑧RNA聚合活性突变体。对Taq DNA聚合酶底物谱的改变，是其分子改造的一个重要成果之一，除了前面介绍的增强Taq DNA聚合酶掺入ddNTP、dNTP标记物等非标准脱氧核糖核苷酸的突变体，还有些研究将Taq DNA聚合酶变成了Taq RNA聚合酶。Xia等（Xia, 2002）以Stoffel片段为模板，通过基于噬菌体展示的定向进化，将其RNA聚合活性提高103-104。
Ong等（Ong J L, 2006）通过一种称为short-patch CSR的定向进化方法，得到一个突变体AA40（E602V，A608V，I614M，E615G）能够以与wt酶掺入dNTPs相同的催化效率掺入NTPs和dNTPs。
⑨跨损伤扩增突变体。Taq DNA聚合酶的跨损伤突变体，大多是由使用CSR技术而闻名的Holliger实验室完成的。d'Abbadie等（d'Abbadie, 2007）以Taq、Tth、Tfl三种聚合酶为亲本，经StEP混组和三轮CSR筛选得到若干突变体，扩增47,000-60,000年前的洞熊DNA时，成功率比野生酶显著提高。Loakes等（Loakes, 2009）通过CSR得到一个突变体5D4，能过聚合疏水性碱基类似物，后来Millar等（2015）将5D4用于重亚硫酸盐测序，结果发现5D4能够很好的跨过DNA损伤。此外，Obeid等（Obeid, 2011）以KlenTaq为模板，通过定向进化得到两个突变体I614K和M747K，它们获得了增强的跨损伤扩增能力。Obeid等I614K和M747K组合在一起后，双突变体的跨损伤扩增能力修复能力比单突变体显著增强。不过，这些突变体跨损伤能力的增强，是以牺牲保真性或者正常DNA扩增效率为代价的，它们应用范围比较狭窄，商业化价值不是太大。 -
通过结构域融合得到的突变体
⑩结构域融合突变体。一些来源于嗜热菌的的α-螺旋结构具有稳定DNA的作用，Pavlov等（Pavlov, 2002）将DNA拓扑异构酶V上一段重复的螺旋-发夹-螺旋结构融合到Taq DNA聚合酶的N端和C端，结果N端融合酶TopoTaq对Na+、K+、甜菜碱的耐受能力显著提高，并且耐热性也有很显著的增强。Davidson等（Davidson, 2003）将Taq DNA聚合酶的480-485残基替换为T3 DNA聚合酶的硫氧还蛋白结合域（TBD），结果融合体的合成能力提高了20-50倍，移码突变概率降低6-7倍。后来，Wang等（Wang, 2004）将来自Sulfolobus solfataricus的Sso7d双链DNA结合蛋白，融合在Taq和Stoffel片段的N端，结果发现S-Taq与S-Stoffel的持续合成能力比之前显著增强，融合蛋白与野生酶的Kcat基本一致，但Km比野生酶降低4-8倍，融合蛋白还增加了对盐离子的耐受性，令人兴奋的是融合蛋白还没有改变酶的耐热性和保真性。Sso7d的融合“红利”在家族B的Pfu DNA聚合酶上效果更明显，风靡市场的Phusion高保真聚合酶就是Pfu-sso7d。 -
（Wang Y, 2004）Taq，Stoffel和S-Stoffel的PCR效率比较。 以DNA（130 pg / ml）为模板，扩增子的大小显示在底部。 PCR程序为：95°C 20s； 94°C 5s，72°C 30s（A）或60s（B）或2min（C），20个循环； 72°C 7分钟。