基因工程-3-基因工程载体-课堂随记（PPT、补充）

溶源周期：随着细菌进行复制
溶菌周期：细菌最后裂解

基因组大小
>重组λ噬菌体的基因组DNA太大或太小会影响其存活能力。（不能不插入、也不能插入太长）
>当基因组DNA长度为野生型入噬菌体基因组DNA的78%-105%时，不会明显影响存活能力。
>野生型入噬菌体基因组DNA为48 kb，若用外源DNA片段完全替换可取代区，外源DNA片段的大小将在9-23kb范围内。

lacZ基因（颜色）
lacZ基因也可用于入噬菌体载体，通过插入或替换载体中的β-半乳糖苷酶基因片段，在IPTG/X-gal平板上可通过噬菌斑的颜色，筛选重组噬菌体。

基因cl失活（浑浊不浑浊）
>cI基因的表达促进入噬菌体进入溶原状态，基因cI产物活性受到影响会促进入噬菌体进入裂解循环。
在带有hfl（高频溶原化，high frequency of lysogenization）的E.coli中，λ噬菌体可高效率地进入溶原状态。
>如果外源DNA片段插入基因cI中，将高频率地使hfl突变E.coli进入裂解生长状态。

代表性λ噬菌体载体
>允许外源DNA片段替换非必须DNA片段的载体，称为置换型载体(replacement vectors) 。
>通过特定的酶切位点允许外源DNA片段插入的载体称为插入型载体( insertion vectors） 。
>入噬菌体包装大小范围8-50kb。

替换区有成对的酶切位点。

插入型载体
具有单一的酶切位点，可供外源DNA的插入如入gt10，(仅有EcoRI切点)，在cI基因上有一酶切点，入gt11，在筛选标志LacZ上有一限制酶的切点(EcoRI)。
由于入噬菌体对所包装的DNA有大小的限制，因此一般插入型载体设计为可插入6 kb外源DNA片段，最大11 kb。

3.1.2.2 M13丝状噬菌体载体
(1)M13噬菌体的生物学特征
>M13噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。
基因组为单链DNA，由6407的碱基组成。
>M13噬菌体基因组可编码3类蛋白质。基因二是最重要的

(2）M13噬菌体的增殖
(1)吸附。M13噬菌体只感染具有性纤毛的菌株,
携带F质粒的菌株可产生性纤毛
(2）在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体DNA（正链）在宿主酶的作用下转变成王状双链复制型DNA ( replicative form DNA），即RF DNA。
(3）经过数轮0型复制，形成RF DNA达100-200拷贝。
(4）RF DNA的负链转录成病毒mRNA。
(5）病毒基因II产物在RF DNA的正链特殊部位产生切口
(6）通过复制叉绕着负链模板的移动，不断合成正链子代（滚环复制）。
(7）完整的子代正链在病毒基因II产物的作用下从滚环结构切下，子代正链环化。
(8）子代正链继续合成,最后包装，分泌。

①载体的插入位点
>基因II和基因IV之间的508bp
间隔区是主要的外源片段插入位点。>在基因VIII和基因IⅢ之间的小间隔区也可用来插入外源片段。
>基因X也可用来克隆外源片段。

④丝状噬菌体载体应用
>产生单链特异性探针
>单链DNA可用于基因诱变、测序

)丝状噬菌体载体的优点
>可产生单链DNA或双链DNA，分别用于不同的目的。
√单链:为丝状噬菌体，可分泌到细胞外，用于测序或制备探针
心
√双链:为含双链RF DNA存在于细菌菌落中，可供基因操作，如酶切，重组、提取、转化均应为双链DNA。具有质粒的优点
>丝状噬菌体所能包装的DNA长度没有一定的限制，有些噬菌体颗粒可包装比野生型丝状噬菌体DNA长7倍的DNA。

3.1.2.3噬菌粒载体
噬菌粒(phagemid):在质粒中插入丝状噬菌体的主要基因区域(1.3kb)，构成一种特殊的质粒载体，其基因区包括:
a.噬菌体DNA合成起始和终止区。
b.丝状噬菌体颗粒装配所需的序列
c.带有E.coli的复制点(ori)，因此可像质粒一样扩增。

2种复制方式
>克隆于这些载体内的外源DNA区段可以象质粒一样用常规方法进行增殖。
>带有这种质粒的细菌被M13（或f1）丝状噬菌体感染后，在病毒的基因II蛋白影响下，质粒的复制方式发生改变。
>基因I产物与质粒所携带的基因间隔区相互作用，启动滚环复制，产生质粒DNA一条链的拷贝，最终包装在子代噬菌体颗粒中。

M13KO7辅助噬菌体
M13KO7辅助噬菌体是M13的衍生株，大小为8.7 kb
(1）来自p15A质粒的复制起点，且可以与带ColE1的质粒共存于同一个宿主菌中。
(2）来自转座子Tn903的kan'，用作选择标记。
(3）基因导致突变基因II产物优先与克隆于噬菌粒pUC118和pUC119中的病毒复制起点，确保在细胞所产生的病毒颗粒中来自噬菌粒的单链DNA能够占据优势。

3.1.3黏粒载体
黏粒(cosmid）是质粒的衍生物，是带有cos序列的质粒,也叫柯斯质粒。
cos序列是入噬菌体DNA中将DNA包装到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。（两个cos位点之间）
黏粒的组成包括质粒复制起点（ColE1)、抗性标记( ampr) 、cos位点，因而能像质粒一样转化和增殖。

Supercos-1克隆的原理和
步骤
Supercos-1大小为7.94kb，含有在真核细胞中起作用的来自猿猴病SV40的复制起点ori-SV40和新霉素抗性基因

去磷酸化处理防止载体自连。

黏粒（带有cos位点的质粒）的缺点
>两个粘粒之间，当存在同源序列时，可能会发生重组，结果使克隆的外源DNA片段重排或丢失。
>含不同重组DNA的菌落生长速度不一，结果会出现各种外源DNA片段间的比例失调。
>包装蛋白制备过程较复杂，每批包装蛋白的包装效率不稳定。而且，购买包装蛋白的费用较高。

3.1.4人工微小染色体载
体
3.1.4.1酵母人工染色体载体
>酵母人工染色体YAC (Yeast Artificial Chromosome )
>利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。
>酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，含16条染色体，其大小为225-1900kb，总计有14×106bp;具真核mRNA的加工活性。

YAC载体必须含有元件
①自主复制序列( autonomously replication
sequences，ARS)
含有酵母菌中DNA进行双向复制所必须的信号。
②着丝粒（( centromere，CEN)，使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中。在YAC中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。如pYAC4使用的是酵母第四条染色体的着丝粒。
③端粒重复序列( telomeric repeat，TEL)
，用于保护线状的
DNA不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。

3.1.4.2细菌人工染色体载体
(BAC)
>细菌人工染色体（ Bacteria Artificial Chrc
omosome，RA)其i
于大肠杆菌的F质粒构建的高通量低拷贝的质粒载体。
>F质粒是一个约100kb的质粒，编码60多种参与复制、分配和接合过程的蛋白质。
虽然F质粒通常以双链闭环DNA （1-2拷贝/细胞）的形式存在,但它可以在大肠杆菌染色体中至少30个位点处进行随机整合。>F质粒可通过性菌毛转移给受体细胞。

4.3.1 BAC载体及其结构组成
>约7.5kb，其本质实际上是一个质粒克隆载体。
>复制单元的特殊性:来自F质粒，包括严谨型控制的复制区oriS,启动DNA复制的由ATP驱动的解旋酶（RepE）以及3个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座（pd
arA、parB和parC) 。
>低拷贝性可以减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。>标记基因:氯霉素抗性基因

小结
克隆载体通常必须具备特点:独立复制;选择标记;限制酶位点;有较高的拷贝数。
克隆载体种类:质粒;噬菌体;黏粒;人工染色体载体;各种载体的特点、筛选方式和工作原理。

3.2表达载体

入噬菌体的P,启动子调控
>入噬菌体的P,L启动子受cI基因产物的调节，cI阻抑物抑制转录的启动
>利用P启动子的载体一般在?噬菌体溶原的大肠杆菌中表达。
溶原性噬菌体上的cI基因是温度敏感的，如M5219菌株含有clts857突变。在低温（30C)下，该突变的cI阻抑物能抑制PL启动子的转录，而在高温下（40-45C）失去活性，PL启动子的表达不受抑制。

(2)核糖体结合位点
细胞中的核糖体必须在mRNA上找到有效的核糖体结合位点
(RBS）以及其中的Shine-Dalgarno序列(SD序列），从而启动邻近其下游的翻译起始密码子的蛋白质翻译。

3.2.1.2诱导表达系统
>通过诱导表达，可防止基础表达（渗漏表达)，特别是可防止某些有毒产物对细胞的毒害。
>启动子lac及其衍生启动子tac都是诱导型启动子，在IPTG诱导下启动转录。