今天精读的文献是2月13日发表在《Nature Plants》上的《Integration of ovular signals and exocytosis of a Ca2+ channel by MLOs in pollen tube guidance》
早期接触MLO这个家族还是读遗传发育所高彩霞老师发表在《Naure Biotechnology》上论文，她们用Crispr技术敲掉了小麦中的MLO（小麦是六倍体，基因有三个拷贝，难度大），发现高抗白粉病，那时候我还在读大三，再次接触这个家族是今年寒假初期，罗静初老师让我找一找植物中是否存在GPCR，当时了解到MLO本身是一个七次跨膜蛋白，但是没有G蛋白偶联，所以可能并不是一个标准的GPCR，也看到拟南芥中这个家族在生殖过程中有表达，所以也猜测可能会有作用，没想到没过两周文章就发出来了。真的是世事无常啊！闲话不多说，先读文章为敬！
本篇文章的通讯作者是遗传发育发育所的杨维才老师，他的研究工作主要聚集在植物生殖发育的分子遗传学，尤其是 雌配子体和胚胎发育过程中细胞极性、细胞命运、细胞分化和雌雄配子细胞相互作用的分子遗传机制。其目标是利用拟南芥、水稻等模式植物来探讨发育生物学的基本问题，并以此为模式研究农作物基因功能。在先前的研究中发现花粉管在极性生长时，存在大量细胞质Ca2+的动态变化参与，但是来自胚珠信号是如何参与这一过程目前还不清楚，本次揭示 MLO5 MLO9和MLO15这三个基因在此过程中起作用。
在植物生长发育，遇光，接触以及外界胁迫等其他情况时，细胞质中Ca2+一般能够作为第二信使传递信号，这种Ca2+信号传递依赖于钙离子渗透通道（进入细胞质中），Ca2+-ATPase（Ca泵，泵出细胞）以及Ca2+/H+ exchangers（Ca2+/H+反向转运蛋白，存进液泡），其中Ca2+离子通道包括有 CNGCs(cyclic nucleotide-gated channels), GLRs(glutamate receptors), annexins, two-pore channel 1 hmechanosensitive channels。而MLO作为跨膜蛋白很有可能在信号传递过程中发挥作用，MLO在拟南芥中共有15个成员，MLO1, MLO5和MLO9表达在花粉和花粉管中，而且MLO5的表达受到花粉管穿过柱头的诱导。所以作者猜测这几个基因能够在生殖过程中起作用。
所以作者的科学问题是依据基因的表达量和特异性推测的MLO成员是否在生殖中其作用呢？
所以作者首先利用qRT–PCR的办法验证这个基因的表达到底高不高？（算是核验一下RNA-seq的结果）可以看到在花粉当中MLO1/5/9/15表达量相对较高，且MLO5和MLO9的特异性很强，仅仅在花粉中表达，不在根中表达，且演化树聚在一支上，可能存在功能冗余，此外MLO1和MLO15在花粉和根中都表达，且演化树都聚在一支上。任何一个单突没有表型，mlo5-1mlo9 (T-DNA)双突在种子产量以及花粉萌发的过程中都没有任何问题，但是在mlo5-1 mlo9+/– 后代分离比出现了与1:2:1的偏离，并且mlo5-1mlo9 雄配子体传递率严重下降（44.5%），但是雌配子体传递率不受影响，说明主要是雄方的问题。这就不禁引起作者的好奇。利用苯胺蓝染色（将细胞组织中的胶原蛋白染色为水蓝色）观察花粉管穿过柱头，mlo5mlo9 双突的花粉管当接近珠柄时在隔膜附近缠绕起来，但是有的花粉管在缠绕之后又能爬上珠柄完成受精，但是无疑会降低对胚珠的竞争力。mlo5-1 mlo9 花粉管出现缠绕的概率大约是64%。作者猜测种子产量没有下降的原因是花粉足够，于是采用限量授粉，发现双突的材料的导向胚珠的能力的确是大大下降,并且这一表型能够被MLO5-GFP 和 MLO9-GFP互补。观察MLO5 MLO9 的定位发现都定位在质膜和花粉管的膜内囊泡中。由于MLO预测含有一个CaM-binding的结构域，作者认为这个结构域对蛋白的定位非常重要，于是将MLO5该结构域的关键位点进行W443R的突变，膜定位消失并且互补功能也丧失。此外，mlo5 mlo9 双突花粉管在授粉3h或5h生长速度较慢，但是在8h后看不到差异。于是他们认为MLO5/9在响应雌方的信号物质存在缺陷。
为了进一步探究MLO5和MLO9的功能，作者进行了半体外授粉实验进行详细观察。在这个实验当中，作者观察到仅有12%左右的花粉管出现缠绕或者展开，远远低于体内的比例。作者猜测这是由于半体外受精打破了隔膜和珠柄的联系，例如培养基上分泌不出足够的信号或是在体外隔膜和珠柄之间的90°角并不存在。当胚珠靠的足够近时，异常并不存在。如果使用AtLURE1.2作为吸引物质，发现双突和WT出现打转比例差不多，暗示打转的表型可能是由于其他未知的信号决定的。如果将 mlo5/9 的花粉受给胚珠缺陷的spl 或是 ino 突变体，可以看到打转的比例大大下降，有趣的是如果受给近缘物种 lyrata，打转的比例也是大大下降，暗示着吸引物质是一个雌方分泌的物种特异的信号。
MLO5自身启动子驱动蛋白表达能够互补 mlo5 mlo9 双突的表型。mlo5mlo9 的花粉管对低外源Ca2 +浓度敏感，对Ca2+通道阻滞剂La3 +不敏感，于是作者推测MLO5/9可能在作用于钙内流的过程中发挥功能，利用G-CaMP5的成像Ca2+，可以看出Ca2+在细胞质内的浓度大大下降，仅仅在花粉管顶端有表达。那到底MLO5/9如何影响Ca2+的呢？在先前的研究过程GNCG18以及GLR1.2被报道参与了花粉管的生长和导向过程，如果在 mlo5/9 突变体背景下观察GNGC18和GLR1.2的定位，可以发现CNGC18的蛋白定位大大减弱,但是GLR1.2不受影响。此外一些其他生殖相关的膜蛋白PIP2;7-GFP, MDIS1-GFP, PRK6-GFP,ANX1-GFP, Lti6b-GFP 和 RABA4d-GFP在 mlo5/9当中均不受影响。如果使用两个 cngc18 的点突突变体，苯胺蓝染色发现打转或是分支的表型没有出现，并且cngc18 对 Atlure1.2处理不敏感。进一步研究发现无论是在 mlo5/9 又或是 WT 背景下CNGC18 的转录水平无明显变化，但是如果在双突背景下过表达能够回补半体外的打转表型。因此CNGC18可能部分参与到 mlo5/9 介导通路当中。
那会不会还有其他的MLO基因与MLO5/9存在功能冗余呢？于是他们在 mlo5/9 的基础上进一步敲除了 MLO15，发现这种花粉管打转转的表型进一步提升，并且出现败育的表型，败育的位置在角果中随机出现，暗示花粉管的生长没有问题。为了进一步探究MLO家族的冗余性，他们利用 MLO1-GFP, MLO15-GFP 和 MLO2-GFP进行回补，发现仅仅有MLO1 和 MLO15 能够回补 mlo5/9 的表型。因此MLO1/15可能与MLO5/9的功能相近。
为了进一步阐述MLOs和CNGC18的关系，他们在含有AtLURE1.2的培养基中观察了Ca2+的变化，在WT中花粉管转向发生改变时，会检测到钙的不对称分布，但是在 mlo5/9 中不对称分布消失。有趣的是，MLO9-GFP也会在花粉管转向的过程中发生定位极性分布，暗示着MLO9和CNGC18参与介导了导向性生长期间Ca2+的内流。
那么MLO是否能够直接招募CNGC18呢？通过酵母双杂，他们确定了MLO9与MLO5和CNGC18的相互作用，通过截短实验，发现MLO5的C端与CNGC18的LCI的相互作用。详细观察MLO5和CNGC18的囊泡定位，发现两者并不overlap，如果用ConcA，一个诱导顺式高尔基体和内体聚集以及分泌的阻碍物，发现两者囊泡定位在完全不同的结构中。
通过大规模的酵母双杂实验，鉴定到MLO5与 VAMP721 和 VAMP722存在相互作用，这两个蛋白属于SNARE蛋白，调控胞吐过程中囊泡与细胞膜的融合。MLOC 与CNGC18C 和 VAMP721longin均存在互作。vamp721 和 vamp722 单突均没有表型，双纯种系致死，一纯一杂的突变体同样也会出现打转转的表型。并且CNGC18-GFP在vamp721 vamp722 出现两种不同定位，暗示着VAMP721/722调控了CNGC18的运输过程。
读完这篇文章，我总感觉有些绕来绕去。不否认这篇文章做了大量的工作,但是很多结果值得商榷，MLOs与花粉管导向的关系以及MLOs与Ca2+之间关系，仍然可以继续探讨。