Motility-based label-free detection of parasites in bodily fluids using holographic speckle analy...

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寄生虫感染是一个重要的全球公共卫生问题。基于手动显微镜检查的现有筛选方法通常难以提供足够的体积通量和灵敏度以促进早期诊断。在这里，我们展示了一种基于运动的无标记计算成像平台，通过利用寄生虫的运动作为特定的生物标志物和内源对比机制，快速检测光学密集体液中的运动寄生虫。基于这一原理，建立了一种经济有效的移动式仪器，可以快速筛选三维的~3.2 mL流体样品，使用全息延时散斑图案自动检测和计算运动微生物。我们通过检测锥虫来展示我们平台的能力，锥虫是活动的原生动物寄生虫，其中各种物种引起致命疾病，影响全世界数百万人。使用全息散斑分析算法结合基于深度学习的分类，我们证明了加标全血和人工脑脊液（CSF）样本中锥虫的敏感和无标记检测，达到每毫升全血10个锥虫的检测限（〜比目前最先进的寄生虫学方法好五倍）和每毫升CSF三个锥虫。我们进一步证明，该平台可用于检测其他运动寄生虫，通过对滴虫病的致病因子毛滴虫（Trichomonas vaginalis）进行成像，该因子影响全世界2.75亿人。凭借其经济，便携的设计和快速的筛选时间，这个独特的平台有可能用于敏感和及时诊断由资源有限的地区的运动寄生虫和其他寄生虫感染引起的被忽视的热带疾病。

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  寄生虫感染影响全球数十亿人，造成巨大的社会经济负担1-4。 虽然它们通常与低收入国家有关，但寄生虫感染正在成为发达国家日益增长的健康问题。 在美国，数百万人受到各种寄生虫的影响，这些寄生虫可能导致严重的疾病甚至死亡1。 从单细胞致病细菌和寄生原生动物到多细胞寄生虫和外寄生虫，致病生物中的运动是常见的。 生物体从一个位置移动到另一个位置的能力对于成功的感染和传播具有明显的益处，并且运动通常是毒力的核心5-7。尽管寄生生活方式的运动的重要性，寄生虫运动仍然是研究的未充分研究领域。 和基于运动的诊断方法相当不足。

  非洲人类锥虫病（HAT），也称为昏睡病，以及恰加斯病（即美洲锥虫病），是由运动原生动物寄生虫引起的被忽视的热带病的例子。被忽视的热带病在历史上很少受到关注，不成比例地影响世界上最贫困的人群，缺乏足够的诊断和治疗医疗干预措施。不存在针对这些疾病的疫苗，并且现有的化学治疗剂具有高毒性和耐药性8-11。两种破坏性疾病-HAT和恰加斯病是由相关的锥虫寄生虫引起的12。布氏锥虫（T. brucei gambiense和T. brucei rhodesiense亚种）是HAT9,10的原因，相关物种引起的动物疾病在世界上一些最贫困的地区造成了巨大的经济负担。寄生虫通过采采蝇传播给人类，并在血液和组织中细胞外存活，对中枢神经系统有显着影响9,10。 HAT在约30个撒哈拉以南非洲国家流行，约有6500万人有感染风险4。报告的病例数已降至历史最低水平，但过去的病例数下降后出现了重大流行病。因此，HAT仍然是人类健康的重要风险13。南美锥虫病是由克氏锥虫（T. cruzi）引起的，它在宿主细胞内侵入并复制并在宿主组织内引起严重的病理14。虽然南美锥虫病主要通过三嗪虫的叮咬传播，但其他传播途径包括输血和摄入受污染的食物或饮料15。这种疾病在拉丁美洲流行，在那里它影响了600多万人11,15,16。据估计，随着全球化和气候变化影响疾病传播媒介的分布，预计美国将有超过30万人受到感染17。

  两种锥虫都可分为初期阶段，其中锥虫在血流中循环并且药物治疗是最有效的（I期HAT和急性恰加斯病）和后期即使不是不可能治愈也非常困难（第二阶段HAT和慢性恰加斯病）。因此，早期发现对两种疾病都至关重要。然而，快速和敏感的诊断仍然具有挑战性，特别是在资源有限的环境中18。在HAT的诊断中，评估疾病的阶段对于确定适当的治疗策略至关重要。虽然锥虫体保留在I期HAT的血液和淋巴液中，但II期HAT的特征是穿过血脑屏障并侵入中枢神经系统的锥虫，其引起神经症状并且如果不治疗则最终死亡。由于用于治疗I期和II期的药物不可互换且II期药物毒性较大，因此确定疾病分期对于选择治疗方案至关重要。目前通过腰椎穿刺收集脑脊液（CSF）并在显微镜下检查CSF是否存在白细胞（WBC）和锥虫来进行分期测定。

  两种锥虫种类的长度和宽度分别通常为~ 20μm和~3μm，并且两种胰蛋白酶物种都使用鞭毛介导的寄生虫推进运动9,19,20。检测大量体液（例如血液和脑脊液）中的这些运动性对位是一项重要的临床挑战。几十年来，T。的标准筛选试验。冈比亚HAT一直是锥虫病（CATT）的卡片凝集试验，它可检测出针对特定寄生虫抗原4的抗体。然而，CATT在某些方面存在实际限制以及低特异性和敏感性4。此外，阳性CATT试验通常必须通过血液样本中的直接目视观察来确认。已经开发了几种分子和免疫学检测方法，包括聚合酶链反应（PCR）和快速诊断测试（RDT）。然而，这些方法受到特殊性或灵敏度不足，对复杂设备和训练有素的人员的需求或高生产成本的限制4,21,22。因此，显微镜评估仍然广泛用于初级或二级诊断，直接观察脑脊液仍然是HAT分期确定的唯一方法4,22。每毫升全血通常含有数十亿的红细胞（RBC），数百万的白细胞和数亿个血小板。相反，血液寄生虫血症在感染过程中波动，并且通常小于100个寄生虫/ mL18,23,24，这使得锥虫的显微鉴定成为大海捞针问题。因此，直接观察方法的低灵敏度需要分析分离装置，例如离心或离子交换纯化，这部分限制了资源有限环境中的分析25-27。因此，迫切需要开发具有高灵敏度和高通量的新方法，以降低成本并简化诊断。

  为了应对这一重要挑战，我们展示了一款经济高效的便携式光学设备（图1），该设备基于无透镜时间分辨全息散斑成像，可实现无标签，高通量和灵敏度检测各种体液和混浊介质中的运动寄生虫我们的技术不是染色目标分析物或使用分子生物标记物，而是利用自我驱动寄生虫（或其他运动微生物）的运动作为生物标志物和内源性对比机制。因此，样品制备非常简单快速，不需要任何台式规模的样品处理装置/设备，冷藏，离心或纯化（图2）。如图1a所示，待屏蔽的流体样品由相干光源（例如，激光二极管）照射，并且互补金属氧化物半导体（CMOS）图像传感器放置在样品下方以记录时间 - 变化的全息散斑图案的样本。该图像序列通过定制编写的计算运动分析（CMA）算法进行分析，该算法基于全息术生成三维（3D）对比图，该图特定于样本体积中寄生虫的运动。基于深度学习的分类器用于使用重建的3D运动图自动检测和计数对位的信号模式（图3）。为了快速增加吞吐量并降低检测限（LoD）筛选大流体体积（~ 3.2mL），我们构建了一个原型，由三个相同的无透镜散斑成像模块组成，安装在线性平移台上，以平行筛选三个单独的样品管（图1a和补充电影1）。每个成像模块被转换成包含液体样本的毛细管的不同部分，其中CMOS图像传感器在前进到下一部分之前捕获高帧率视频序列。使用这种方法，使用图1所示的设置，在约20分钟内制备，筛选和分析~3.2 mL流体样品。与标准台式光学显微镜相比，我们的设计提供了筛选样品体积大幅增加的顺序（这对于检测低浓度的寄生虫非常重要）并且更加紧凑和重量轻（1.69kg）。此外，由于大量样品在轴向上进行了计算筛选，因此我们的成像设备在光学机械设计中不需要高精度，这也使我们的平台具有极高的成本效益，即使在整个零件成本低于1850美元的情况下也是如此。非常小批量生产。

  我们使用锥虫来测试我们的移动平台并证明其能够检测加标全血和CSF样本中的寄生虫（图2），这对于HAT的诊断和分期测定以及急性恰加斯病的诊断非常重要。我们使用T.brucei brucei（非人类传染性亚种锥虫）作为T.b.的模型寄生虫进行了一系列浓度的掺加实验。冈比亚人，T.b。罗得西亚和T. cruzi。通过基于深度学习的分类，我们发现使用我们的平台可以可靠地检测每毫升全血中少至10个寄生虫和每毫升CSF 3个寄生虫。此外，我们通过成像阴道毛滴虫（T. vaginalis）成功检测了我们的平台检测体液中的其他运动寄生虫，这是一种导致毛滴虫病的原生动物寄生虫，这是一种影响370万的最常见的非病毒性传播疾病。美国人口2.75亿人口28。我们相信，这种无标签，基于运动的寄生虫检测平台可以提供经济有效的便携式方法，在资源有限的环境中快速，灵敏地筛选锥虫和其他运动寄生虫，或作为高通量分析研究工具从三个方面研究运动生物。